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全基因组表达谱芯片筛选及表达规律研究 随着人们生活水平的提高和兔子大规模纺织技术的提高，兔子的需求。长毛兔是典型的毛用兔,其被毛洁白、松软、浓密,因此备受广大消费者的青睐。如何提高我国长毛兔被毛密度和品质以满足消费者的需求,是目前亟待解决的问题。前人研究发现了一些参与毛囊发育过程的候选基因,如KAP、BMP2、MMP2、μPAR、TGF、IGF-1、FGF5、Hox家族基因等,但是仍然有很多未知基因有待探索。新西兰白兔为肉用型家兔,其被毛为标准毛型,被毛密度较稀,毛纤维直径较粗且粗毛含量高;皖系长毛兔为毛用型家兔,其被毛为长毛型,被毛密度高,毛纤维直径较细。本研究以被毛结构和被毛密度差异较大的新西兰白兔和皖系长毛兔为实验材料,利用家兔全基因组表达谱芯片筛选与毛纤维生长发育相关的基因,随后以皖系长毛兔(毛用型)为实验材料,采用实时荧光定量RT-PCR法研究Wnt10b、SFRP2基因在皖系长毛兔中的表达规律,为后期研究控制毛纤维生长发育基因的功能奠定基础。 1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验示例 1.1.2 芯片 家兔全基因组表达谱芯片购自Agilent公司,规格为4×44K。上海伯豪生物芯片公司协助完成基因芯片筛选差异基因实验。 1.2 实验方法 1.2.1 实时荧光定量pcr实验 采用TRIZOL法分别提取皖系长毛兔和新西兰白兔的皮肤组织总RNA。抽提所得总RNA经电泳质检合格后使用RNeasy minikit和RNase-Free DNase Set纯化。分别将2个兔品种的4个RNA样本等量混合RNA池,并分成2份,一份用于芯片实验,一份用于实时荧光定量PCR初步验证实验。同样采用TRIZOL法分别提取来自安徽省农科院种兔场不同周龄皖系长毛兔体侧部和臀部的皮肤组织RNA,每个周龄2公2母共8个RNA样本,保存于-70℃冰箱,用于实时荧光定量PCR探究差异基因在皖系长毛兔中的表达规律,进一步验证芯片结果。 1.2.2 pcr实时荧光定量测试结果 1.2.2. 荧光定量引物设计及rt-pcr扩增 采用SYBR Green法进行实时荧光定量PCR试验以初步验证芯片结果的可靠性。上述另一份RNA利用Fast Quant RT Kit(With g DNase)(北京天根生化科技有限公司)反转录合成c D-NA,根据NCBI中Wnt10b、Shh、SFRP2、GAPDH的基因序列,设计荧光定量引物(表1),引物由大连Ta Ka Ra公司合成。 RT-PCR反应体系(20μL):2×Ultra SYBR Mixture(With ROX)10μL,上游引物(Forward Primer)10μmol/L 1μL,下游引物(Reverse Primer)10μmol/L1μL,双蒸水(RNase-Free Water)7μL,c DNA模板1μL,每个样本设置3个重复。 RT-PCR反应程序:95℃预变性10 min;95℃变性20 s,58℃退火/延伸30 s,72℃25 s,40个循环;95℃1 min,55℃30 s,95℃20 s。 1.2.2. dna反转录合成 利用Fast Quant RT Kit(With g DNase)(北京天根生化科技有限公司)将上述皖系长毛兔各个周龄体侧部和臀部的RNA反转录合成c DNA。Wnt10b、SFRP2、GAPDH基因引物序列、试验方法同1.2.2.1。 1.3 荧光定量pcr数据处理 实时荧光定量PCR数据分析,先用Miscrosoft Excel初步处理Wnt10b、Shh、SFRP2基因的实时荧光定量PCR数据,相对定量的结果采用-ΔΔCt算法进行处理:ΔΔCt=(待测组目的基因平均Ct值-待测组管家基因平均Ct值)-(对照组目的基因平均Ct-对照组管家基因平均Ct值)。然后用SPSS软件One-Way ANOVA进行方差分析,用最小显著极差法(LSD)进行多重比较。Wnt10b、SFRP2基因相对表达量结果均以平均值±标准差表示。 2 结果 2.1 测定浓度的测定 用1.5%琼脂糖凝胶检测总RNA的完整性,核酸蛋白测定仪测定浓度,稀释至100 ng/μL,-70℃保存备用。由图1可知,提取的RNA 28S、18S条带清晰,无明显降解,其OD260/OD280在1.7左右,纯度较高。 2.2 谱芯片的结果 SAS分析发现在这714个差异基因中,Wnt10b、Shh、SFRP2基因与毛纤维生长发育相关(表3)。 2.3 荧光定量pcr检验发现光谱芯片的结果 2.3.1 fpr2基因在皮肤组织中的表达 表达谱芯片结果发现,Wnt10b、Shh基因在皖系长毛兔皮肤组织中的表达量显著高于新西兰白兔皮肤组织;SFPR2基因在皖系长毛兔皮肤组织中的表达量显著低于新西兰白兔皮