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产淀粉糖化酶米曲霉的筛选与鉴定 作为一种发酵黄酒的糖化剂，麦曲含有大量的微生物可以分泌淀粉糖化酶。糖化酶可将淀粉转化为葡萄糖，然后被微生物发酵，生产酒精。糖化酶活力高,原料利用率就高,因此筛选高产糖化酶菌株对酿酒工业具有重要意义。本研究从不同麦曲中分离筛选高产淀粉糖化酶菌株,依据形态特征和ITS序列分析对筛选菌株进行鉴定,并研究了粗酶的酶学特性。 1 材料和方法 1.1 in认为 斜面培养基:马铃薯(去皮)200g,葡萄糖20g,水1000m L,琼脂20g,自然p H值,121℃湿热灭菌20min。 选择性平板培养基(产透明圈):可溶性淀粉2g,蛋白胨0.5g,琼脂20g,氯化钙0.4g,磷酸氢二钠0.8g,自然p H值;水1000m L,121℃高压蒸汽灭菌20min。 固体发酵基础培养基:麸皮8g,玉米粉1g,大豆粉1g,盐溶液10m L,121℃高压蒸汽灭菌20min(盐溶液:K2HPO42%,(NH4)2SO44%)。 1.2 淀粉糖化酶活力测定 初筛:取粉碎好的麦曲10g,装入带玻璃珠的90m L无菌水的三角瓶中,摇晃打散,使麦曲中的微生物形成悬浮液,用无菌移液管对悬浮液进行稀释,稀释至10-1~10-6。吸取各种稀释度溶液0.1m L涂布于选择性培养基平板上,置于30℃恒温培养箱中培养3d,取出培养皿,滴加卢戈氏碘液,测量透明圈直径D和菌株直径d。挑取D/d较大的菌株接种斜面保藏。 复筛:无菌水洗出孢子,用血球计数板调整孢子浓度,接种于固体培养基中。混匀后,30℃培养72h,培养期间每隔一段时间摇动一次。培养结束后,加入50m L蒸馏水并将固体培养基捣碎,40℃水浴1h,取出粗酶液8000r/min离心5min,弃沉淀得粗酶液,测定淀粉糖化酶活力。 淀粉糖化酶活力测定采用碘量法。酶活力单位定义为1m L酶液,于40℃、p H 4.6的条件下,1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖,即为1个酶活力单位,以U/g(U/m L)表示。 1.3 提取细菌dna和pcr扩增 采用北京索莱宝科技有限公司的真菌基因组提取试剂盒提取纯株真菌的基因组DNA。1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR扩增参照方华等的方法。 1.4 酶特征的研究 1.4.1 温度对水浴锅酶活力的影响 在自然p H值条件下,将酶液和淀粉混合液分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴锅中水解30min,测定酶活力,考察温度对酶活的影响。将酶液分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴锅中加热30min,然后再加入淀粉溶液,在40℃测定残余酶活力,考察温度稳定性。每组重复3次,取平均值。 1.4.2 ph值对产酶的影响 配制p H值不同的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液:p H3.0、p H4.0、p H5.0、p H6.0、p H7.0,在40℃分别测定酶活力,考察p H值对酶活的影响。将酶液置于不同p H值的缓冲液中30min,然后再加入淀粉溶液,40℃酶解30min,测定酶活。每组重复3次,取平均值。 1.4.3 金属离子对淀粉酶活性的影响 在反应体系中分别加入1m L浓度为1mmol/L的各种金属离子,研究金属离子对淀粉酶活性的影响。 2 结果与分析 2.1 景观菌株的复筛 滴加卢戈氏碘液后,静置30min。观察培养皿中有无透明圈,若有,测量菌株直径d和透明圈直径D,挑选D/d较大的菌株进行复筛。复筛结果见表1,其中菌株A17糖化酶活力最高。 2.2 香辛料ls1b 菌株A17的菌落形态和镜检形态见图1。 A17的菌落形态:菌落生长快,10d直径达5cm~6cm,质地疏松,初白色、黄色,后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。在含0.05%茴香醛的察氏培养基上,分生孢子呈现红色。 A17的镜检形态:分生孢子头放射状,直径150μm~300μm。分生孢子梗2mm左右,无隔膜。顶囊近球形,分生孢子卵圆形或近球形。 2.3 系统发育树的构建 将菌株A17的ITS序列结果通过Blast程序与Genbank中核酸数据进行比对分析,构建系统发育树见图2。结果表明,菌株A17的ITS序列和曲霉菌的结构相似,结合其形态特性(图1)和ITS序列比对结果,初步鉴定菌株A17为米曲霉。 2.4 酶特征的研究 2.4.1 酶最适温度的确定 温度对酶活力及酶热稳定性的影响见图3。在30℃~60℃时,随着温度升高,酶活力逐渐增大,60℃后,该酶蛋白由于高温部分失活,活力下降,因此,该酶的最适温度为60℃。由酶的热稳定性曲线可知,酶在30℃~55℃较稳定,相对酶活力保持在80%以上,当温度升高为60℃时酶活迅速下降为40%左右,因此,该酶的热稳定范围为30℃~55℃。 2.4.2 最适ph的确定 p H值对酶活力的影响及酶的p H值稳定性见图4。由图4可知,该酶在p H 3~7都具有较