植物生物技术6_实验三：植物原生质体的分离、纯化与检测-华中农业大学课件.pdfVIP

实验三 植物原生质体的分离、纯化与培养 一、实验目的 了解植物原生质体分离和纯化的原理，掌握植物原生质体分离、纯化和培养的方法，掌 握原生质体活力测定和原生质体计数的方法。 二、实验原理 植物原生质体是指细胞中去掉了细胞壁后的部分，包括原生质膜、细胞质、细胞核等结 构。植物细胞在纤维素酶，半纤维素酶和果胶酶的作用下，细胞壁被消化，纤维素酶的作用 是降解构成细胞壁的纤维素，果胶酶是用来降解连接细胞的中胶层，使细胞丛组织中解离 出来，可以得到裸露的原生质体。原生质体在合适的培养条件下，能再生细胞壁，进行分裂、 生长、形成愈伤组织。进一步分化成根和芽，长成新的植株，表现了植物细胞的全能性。培养 的原生质体在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行原生质体计数。计数 结果以每毫升原生质体数表示。 三、实验材料 棉花YZ1胚性愈伤组织，拟南芥叶片 四、器材与试剂 (1)实验器材：培养室，超净工作台，真空泵，高压灭菌锅，离心机，离心管 15×60mm培养皿，不锈钢筛(140和400目),小烧杯，棉球。普通显微镜，万能荧光显 微镜，载玻片，盖玻片，试管，镊子，解剖刀，摇床，吸水纸，滴管，擦镜纸 (2)实验试剂：MSB固体培养基，MSB液体培养基，双蒸水，70??醇，改良 FDA母液(5ml/lml丙酮) (培养基、洗液和酶液的配制参照附表) 五、实验步骤 1、材料的准备 (1)无菌苗的制备：种子去壳消毒播种在1/2MS培养基上，取生长5~7后的子叶或生 长20天后叶片充分伸展开后可用于分离原生质体。 (2)愈伤组织诱导：种子经表面消毒后接种在1/2MS培养基上，一周后取无菌苗的 KT 0.2mg/L、IBA1.0mg/L+KT0.2mg/L (3)胚性悬浮细胞系建立：在固体培养基上挑选具有分化能力的淡黄色、致密型、颗粒 状、新鲜的愈伤组织，置于110转/分的旋转式摇床上振荡培养。悬浮培养基为MS基本培养 基，去掉硝酸胺，附加1.9g/l硝酸钾，不加激素，每隔7天继代培养一次。继代四到六次用 于分离原生质体。 2、原生质体的分离 (1)愈伤组织原生质体的分离：用镊子挑选0.5g颗粒状、新鲜的愈伤组织于15×60 mm的培养皿中加入2~3ml酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，置于摇床上40转，28℃黑暗 条件下酶解17~20小时。 (1)悬浮系原生质体的分离：用吸管吸取3ml悬浮培养物于15×60mm的培养皿中， 吸干培养基，加入2~3ml酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，置于摇床上40转，28℃黑暗条件 下酶解15~18小时。 (2)叶肉原生质体的分离：把叶片放在15×60mm的培养皿中，并用解剖刀将叶片切成 0.1 cm宽的细条，后加入2ml酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，置于摇床上20转或静置， 28℃黑暗条件下酶解12~14小时。 3、原生质体的纯化 (1)酶解后的原生质体-酶混合物经双层不锈钢网(140和400目)去掉残渣，加入 壁等碎片浮在液面。弃除上清夜，原生质体加入1~2ml的CPW9M轻轻混匀。 (2)在另一离心管中加入3ml CPW25S溶液，在其上轻轻加入混有原生质体的 CPW9M溶液，离心4～5分钟(800rpm),原生质体在两液面形成一条带，其它的杂质及少量 的原生质体沉于管底。 (3)将原生质体轻轻地吸出，转入另一试管，加入CPW9M溶液洗涤，离心4～ 入培养基。使其密度为10?～2×10°。 4、原生质体活性检测 按25 FDA/ml原生质体的比例加入FDA,5分钟后，在荧光显微镜下检测原生质体的活 性(暗视野下发荧光的原生质体数/明视野下原生质体总数)。 (1)将0.5ml纯化好的原生质体悬液加入试管中。 (2)加入12μl FDA溶液(5 mg/ml丙酮)母液，荧光染色5分钟。 (3)吸取少许悬液涂于载玻片上，轻轻加上盖玻片。 (4)在万能荧光显微镜下观察，调整不同光源，取5任意视野分别总原生质体数和有 活力的原生质体数。活力用暗视野下发黄绿色荧光的原生质体数占同一明视野原生质体数的 比例表示。 5、原生质体计数 将悬浮在KM8P培养基中的原生质体，用血球计数板计算原生质体的密度，使每毫升 达到2×10?～5×105个原生质体。 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台 较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个