水飞蓟宾脂质体的一阶导数紫外分光光度法测定.docxVIP

水飞蓟宾脂质体的一阶导数紫外分光光度法测定 从水生飞燕素系科植物中提取的黄酮类化合物，主要成分为水飞燕素系。临床上用于治疗慢性肝炎、肝硬化和中毒性肝脏损伤。SLB难溶于水,已有的工艺是将其制成水溶性的葡甲胺盐、卵磷脂复合物、固体分散体等,以提高生物利用度。脂质体(liposome)作为一类新型靶向药物载体,脉管给药后可显著聚集于肝脏并缓慢释药,这种由肝脏枯否氏(kupffer)细胞吞噬所致的被动靶向,无疑有利于肝位病灶,尤其是肝炎等的治疗。我们以SLB为模型药,首次尝试制备水飞蓟宾脂质体(silybin liposomes),为控制其质量,本文建立了一阶导数分光光度法,用于水飞蓟宾脂质体包封率及水飞蓟宾含量测定,该法操作简便,易于推广。 1 实验仪器与设备 UV-2401PC紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司);旋转蒸发仪(德国Heidolph);层析柱(天津玻璃仪器厂);超声清洗仪(无锡超声电子设备厂);水飞蓟宾(中国药品生物制品检定所);豆磷脂(上海黄浦江磷脂公司);其余试剂为分析纯。 2 方法和结果 2.1 脂质体制备 2.1.1 白色脂质体的制备 豆磷脂、甲醇、氯仿及其它辅料按一定比例配方,采用薄膜匀化法制备空白脂质体。 2.1.2 脂质沉集法 称取豆磷脂、水飞蓟宾适量,共置于茄形瓶中,加入一定比例的甲醇-氯仿混合溶媒及其他辅料,使溶解至溶液澄清透明,利用真空泵在不断旋转振摇下,蒸发除去混合溶媒,使脂质以薄膜状沉集于瓶的内壁。真空干燥数小时,使残留溶剂挥发殆尽,向茄形瓶中加入一定量的0.9%NaCl水合介质,旋转水合2 h得水飞蓟宾脂质体混悬液。于25 ℃放置数小时,使其充分水合,即得。 2.2 导数光谱法的绘制 2.2.1 水飞蓟宾供试液的制备 精密称取一定量的水飞蓟宾,用甲醇溶解,定容,制成20 mg·L-1溶液,以甲醇为空白,置1 cm石英比色皿中,于250~330 nm内以1 nm为间隔进行扫描,记录零阶光谱,见图1中的曲线1,288 nm处为水飞蓟宾的峰值吸收;取空白脂质体1.0 mL于10 mL容量瓶中,甲醇定容,得供试液1,吸取供试液1 1.0 mL置另一10 mL容量瓶中,甲醇定容,得供试液2。以甲醇为空白,供试液2于250~330 nm以1 nm为间隔进行扫描,记录零阶光谱,见图1中的曲线2。由图1可见,在250~330 nm用零阶导数光谱法测定水飞蓟宾,空白脂质体对测定产生干扰。 2.2.2 水飞蓟宾及空白脂质体的导数光谱图 由水飞蓟宾及空白脂质体的零阶导数光谱,于UV-2401PC紫外可见分光光度计直接进行数据处理,分别获得水飞蓟宾及空白脂质体的一阶导数光谱,见图2。图2表明:空白脂质体的一阶导数光谱在270~300 nm近似于一条直线,而水飞蓟宾的一阶导数光谱在277 nm和294 nm处出现特征峰和谷,据此,可通过测定277 nm和294 nm处峰与谷的振幅ΔA对脂质体中水飞蓟宾的含量进行测定。 2.3 溶液的制备 2.3.1 标准slb溶液的制备 精密称取水飞蓟宾对照品10 mg,置于50 mL容量瓶中,甲醇溶解,定容。所得SLB标准储备液浓度为0.2 mg·mL-1。 2.3.2 磷酸贮存液的制备 取空白脂质体1.0 mL于10 mL容量瓶中,生理盐水定容,摇匀,即得。 2.3.3 巴比溶液的制备 取1.0 mL的生理盐水,用甲醇定容至10 mL。 2.4 磷酸盐溶液的配制 精密移取SLB标准储备液0.0,0.10,0.25,0.5,1.0,1.5 mL,分别置10 mL容量瓶中,各加入1.0 mL磷脂储备液,依次用甲醇定容。以参比液为空白,依次测定各溶液在277 nm处峰和294 nm处谷间的振幅ΔA,并以ΔA对浓度C进行回归,得回归方程:ΔA=3.76×10-3C+1.11×10-3,r=0.999 8, 表明在0.5~30.0 mg·L-1ΔA与浓度呈线性关系。 2.5 回收率的测定 准确配制高、中、低3种浓度的SLB溶液,分别精密量取1.0 mL,置10 mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度。再分别精密量取各稀释液1.0 mL,置10 mL容量瓶中,各加入1.0 mL磷脂储备液,用甲醇定容,摇匀,以参比液为空白,依次测定各溶液在277 nm处峰和294 nm处谷间的振幅ΔA,按回归方程计算浓度,求得回收率,结果见表1。平均回收率为101.7%,RSD为1.8%。 2.6 水飞宾脂质密封率测定 2.6.1 洗脱曲线slb 取充分容胀的Sephadex G-100适量,制备凝胶柱(150 mm×200 mm);精密量取脂质体混悬液0.5 mL上柱,以生理盐水洗脱,流速1.1 mL·min-1,每管1 mL,收集90管。各管收集完毕,加甲醇定容至5 mL;另取1.0 mL生理盐水,