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多聚赖氨酸包被处理的国产载玻片对氨基修饰寡核苷酸的固定 基因芯片技术是在美国转移基础上发展起来的一项高效、快速、高流量基因检测技术。目前，它已非常广泛。该技术主要包括基因片段的制备、基因芯片的制备、检测和混合、芯片扫描分析等基因芯片生产过程中，片基表面处理是光刻化学中最重要的因素，直接影响芯片的质量。dna芯片是目前应用最广泛的基因芯片。其中，偶氮芯片通常由具有元素基、基或环合基或环合基的载玻片制成片基，小型dna通常由多聚基亚太平针片制成片基。在这项工作中，我们讨论了不同处理方法对dna固定率的影响，并为制作dna芯片奠定基础。 1 材料和方法 1.1 荧光标记pcr和mss DNA片段制备所使用的PCR扩增试剂(其中Taq酶为Taq plus,PCR缓冲液中含有Mg2+)购自上海生物工程公司,PCR产物用Mo Bio公司的Ultraclean试剂盒回收;aminoallyl-dUTP和荧光标记染料Cy3购自Amersham公司;荧光标记的PCR产物用Qiaquick nucleotide removal kit回收;进口点样液MSS,购自Array It公司. 载玻片Ⅰ为国产帆船牌载玻片,用多聚赖氨酸自行包被处理;载玻片Ⅱ为聚赖氨酸包被玻璃片,购自Sigma公司. Cartesian Technologies公司Pix Sys TM PA5500芯片点样仪,Packard公司Scan Array Lite芯片扫描仪,基因公司CL-1000紫外交联仪. 1.2 测试方法 1.2.1 p的pcr扩增 寡核苷酸长度为33 bp,3′端带有1个氨基,5′端带有1个分子的Cy3,由上海生工合成.用MSS、3×SSC和水分别溶解,浓度为0.25 pmol·μL-1. DNA片段长度为1 079 bp,来自于CP4EPSPS基因,该基因全长1 368 bp.该DNA片段通过PCR方法制备,PCR反应体系为:1 U Taq酶,1×PCR缓冲液,0.2 mmol·L-1dNTPs,20 ng·μL-1模板DNA,0.25 μmol·L-1引物,反应体积为100 μL.反应程序为:95 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,58 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,34个循环,72 ℃ 10 min.PCR产物用Ultraclean试剂盒回收纯化,用MSS(点样液1)、3×SSC(点样液2)和水(点样液3)分别溶解,浓度为500 ng·μL-1. 1.2.2 多聚赖氨酸包的制备 (1)载玻片清洗.载玻片依次用去污剂、自来水、蒸馏水洗涤,再置于清洗液(2.5 mol·L-1NaOH, 体积分数为60%乙醇)中浸泡振荡至少2 h,然后用双蒸水振荡洗涤4次,每次5 min,800 r·min-1离心干燥. (2)多聚赖氨酸包被处理.将载玻片放在载玻片架上,完全浸入多聚赖氨酸溶液中,在摇床上轻微摇动1 h后,用双蒸水洗涤1 min,然后室温条件下,800 r·min-1离心5 min,干燥后室温下避光贮存于干燥器中,3周以后使用. 1.2.3 荧光染料pcr PCR反应体系同上,仅dNTP终浓度不同,为:0.2 mmol·L-1dATP、dGTP、dCTP,0.12 mmol·L-1dUTP,0.8 mmol·L-1aminoallyl-dUTP.PCR产物经电泳纯化,加入荧光染料Cy3,混合均匀,黑暗中25 ℃水浴1 h.标记后的PCR产物用Qiaquick Nucleotide Removal Kit纯化,去除未标记上的荧光染料,然后以0.1%的比例加入到用点样液溶解的DNA片段的溶液中,配制成样品液. 1.2.4 检测dna片段的制备 取20 μL 样品液,转移到96孔V型底加样板中,制备好的基因片段用Pix Sys TM PA5500点样仪点样.每个样品重复4块载玻片,每片重复42个点. 1.2.5 洗脱液用量的确定 点样后的载玻片先用Scan Array Lite扫描仪扫描,再经过水合(室温下湿盒中放置30 min)、干燥(80 ℃烘干1 h)、紫外交联(900 mJ·cm-2,有或无)处理等步骤.然后依次用洗脱液1(2×SSC,0.1%SDS)、洗脱液2(0.1×SSC,0.1%SDS)、洗脱液3(0.1×SSC)各洗涤5 min,双蒸水洗涤2次,每次5 min,800 r·min-1离心5 min,37 ℃烘干1 h. 1.2.6 测试 使用Scan Array Lite扫描仪扫描,分辨率为5 μm,激光强度为90%,使用AxSysTM软件进行分析. 2 紫外衔接对片段dna固定率的影响 DNA固定率是评价基因芯片制备技术的重要指标,指基因芯片洗脱后,与基因芯片片基结合的DNA占总点样量的百分比.计算公式为:DNA固定率/%=(洗脱后