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木质纤维素降解机制的研究进展 资源和环境问题是人类21年面临的主要挑战。生物资源是可再生生物资源。地球上的年用化工产品达到1.5,101,2,0,1011吨。这是人类社会生存的基本物质来源，其中90%以上是木材纤维材料，目前这些资源尚未完全开发利用。随着世界人口的快速增长和矿产资源的逐渐稀缺，我们必须有效地开发和转化木材纤维资源的微生物技术，并利用工农业废物和其他燃料和原料生产人类所需的燃料、饲料和化工。换句话说，提取原材料的“绿色化”具有极其重要和光明的发展前景。 与淀粉酶相比,纤维素酶的分子转换率要低数十倍.长期以来,关于纤维素降解机制的研究都集中在内、外切纤维素酶(cellobiohydrolaseⅠ,CBHⅠ;endoglucanaseⅠ,EGⅠ)怎样催化纤维素分子链的β-1,4-糖苷键的水解作用方面.20世纪80年代末期在得到了内、外切纤维素酶催化结构域(catalytic domain)的结晶,进行了序列分析和解析了其三维结构等研究的基础上,已基本上弄清纤维素酶催化的水解反应与溶菌酶相似,即都遵循“酸/碱催化”的双置换作用机制.虽然在分子水平上的研究工作已相当深入,但仍然未能阐明天然结晶纤维素难以被降解的原因.我们认为,这主要由于忽略了纤维素分子的超分子结构,即聚集态结构对降解的影响所造成.针对这些难点,开展了多方面的探索性研究,现把取得的进展做一简介. 1 纤维素功能的变化 酶催化反应中,酶分子和底物的构象都会发生相应的变化,即“诱导—契合”过程,但纤维的表面不存在游离的分子链,它们都为葡萄糖残基上3个羟基形成的氢键定向排列为各种取向的聚集态结构.外切纤维酶的活性中心是陷入其催化域内的隧道状结构,只能容纳单一的基元纤维链(葡聚糖链)进入,和在链末端进行水解.因此,Sinnott提出在纤维素分子链中的β-1,4-糖苷键发生水解之前,必需有单一分子链的游离.然而,这都只是推测. 1997年我们报道了拟康氏木霉纤维酶经木瓜蛋白酶有限酶切,得到其外切和内切纤维素酶分子的催化结构域,结合结构域(cellulose binding domain,CBD).CBD具有非水解性的破坏纤维结构,形成短纤维的功能.此后,通过基因工程方法在微紫青霉和瑞氏木霉中克隆出的结合结构域也表现出同样的功能.扫描隧道显微图像显示出经外切纤维素酶吸附结合结构域作用后,微纤维间的排列表现出无序化和单一基元纤维链分离的情景(图1). 而用纤维长度和粗度自动测量仪,对数千根纤维的纤维长度和粗度的自动测量的结果(表1).更进一步证实了经CBD作用后,微纤维键间氢链结合减弱,吸水力增加,导致纤维溶胀(直径增大)的结果.这与红外光谱分析结果也相一致(图2,3).上述实验结果,清楚地显示出经CBD作用后,纤维素聚集态结构的变化,为近年来关于纤维素在酶解过程中其超分子结构应发生变化的推测,给予了试验证实. 2 分子活性化合物 远在半个世纪前,Reese等即提出应存在破坏结晶纤维素的“氢键酶”,但遗憾的是至今未能在微生物中获得证实.1994年,McQueen-Mason,等在黄瓜胚轴中,分离出一种蛋白质——“expansin”,具有使离体的植物细胞壁伸长的作用,也可使滤纸强度减弱,但无还原糖的产生.他们推测这类酶应具有破坏氢键的作用.近来我们由T.pseudokoningii滤液中分离到一个分子量约为24×104的蛋白,pI为7.0.它可使棉纤维,几丁质等膨胀但无还原糖的产生.红外光谱分析表明,它确可减弱棉纤维的氢键区的吸收强度(3600～3200 cm-1羟基吸收区)关于它的结构与功能的研究正在进行中. 3 转换株的产生机理 1996年以来,先后从分属于18属的约50种(株)真菌中检测到可氧化性降解纤维素的短肽类化合物[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13].在拟康氏木霉中和密粘摺菌的培养滤液中分离到毛细管电泳纯的短肽组分:“single fiber genegation factor,SFGF”和“Gloeophyllum trabeum,Gt”,1),并用电子自旋共振法(ESR)检测到Gt引发的羟基自由基HO.和超氧阴离子自由基的产生(图5).结合由其导致的纤维素物理、化学性质的变化,提出了这类短肽化合物,络合并还原铁(Fe3+),活化分子氧,引发Fenton反应和氧化纤维素羟基,促进糖苷链断裂,形成短纤维的作用机理,1). 纤维素和木素主要存在于植物细胞次生壁的中层,大分子的酶无法直接进入次生壁.但电镜切片可观察到,次生壁可首先发生降解.于是研究者们推测,应存在此类可降解木素,纤维素的低分子类化合物.但由于观察到的现象都来自粗酶滤液的混合作用,难于确证.在1997年,才见有部分纯化此类物质的报道.我们在证实此类物质普遍存在的基础上,基