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略阳鸡黑素皮质素受体1基因的遗传进化分析 略阳吴江的中心村位于陕西省秦岭以南略阳县的黑河水库、观音寺、仙台水库和双河口。主要集中在黑河流域，也被称为黑鸡。它已经创造了一个多世纪。这是陕西省唯一的家禽保护品种。经教育部调查过来，司法部长将泰和、云阳和江州列为中国四大吴江品种，并于2008年成立了“中国地理标志”。略阳乌鸡具有六端乌(乌皮、乌喙、乌腿、乌趾、乌舌、乌冠),体形大,生长快、产肉多、肉质细嫩鲜香,营养丰富,兼有药用价值,属优良肉用型地方鸡种,其羽色复杂,有黑,麻、白等,是人民长期选育形成的宝贵资源。乌鸡的滋补、药用价值主要与其体内丰富的黑色素有关,黑色素(melanin)包括天然的黑色素与合成的黑色素。天然黑色素一般分三类:第一类是真黑色素(eumelanin),呈棕色,暗棕甚至黑色,主要存在于家禽黑羽或兰羽、眼、皮肤以及相关的组织中;第二类是脱黑色素(pheomelanin),呈红色、棕色或黄褐色,多分布于家禽红棕色、浅黄色羽毛等组织以及红头发和蓝眼睛中;第三类是异黑色素(auomelanin),呈棕色或黑色,主要存在于植物中。乌骨鸡黑色素属于真黑色素,主要分布于乌鸡的羽毛,皮肤、骨骼和肌肉中。 黑色素合成机理的研究表明[11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21],酪氨酸酶是控制黑色素生成的限速酶,体内酪氨酸在酪氨酸酶催化下生成3,4-二羟基丙苯氨酸(多巴),多巴进一步氧化生成多巴醌,多巴醌经多聚化反应与氧化反应生成多巴色素,在多巴色素异构酶作用下,多巴色素羟化为5,6-二羟基吲哚羧酸(DHICA),脱羧成5,6-二羟基吲哚,再在酪氨酸酶催化下氧化成5,6-吲哚醌,最后与其他中间产物结合形成真黑色素。脱黑色素的形成其前部分由酪氨酸到多巴醌与真黑色素一致,但在以后的反应中有半胱氨酸(Cys)参加,产生Cys-多巴和Cys-多巴醌,通过关环、脱羧,最后形成脱黑色素。笔者等以略阳普通鸡、略阳麻羽乌鸡为对比,采用PCR-SSCP和测序技术,研究略阳鸡MC1R的遗传多样性,分析略阳乌鸡MC1R基因的遗传变异与黑色素形成的关系,探讨略阳乌鸡黑色素形成过程中MC1R的分子作用机制,为开发利用这一宝贵资源提供理论基础。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 黑凤鸡产业园 略阳黑羽乌鸡(LYBF)21只,采自陕西汉中黑凤乌鸡产业园;略阳普通鸡(LYPT)与略阳麻羽乌鸡(LYMY)各1只,均采自汉中农贸市场。 1.1.2 引用序列和引用序列 (表2),由上海桑尼生物科技有限公司合成。 1.2 方法 1.2.1 抗凝 从鸡翅膀静脉采集2 mL血液,加ACD抗凝,放入-70℃低温冰箱保存;根据《分子克隆实验指南》,采用酚-氯仿抽提法提取基因组DNA,溶于TE中,4℃保存。 1.2.2 pcr扩展反应系统和程序 1 pcr扩增pc-pcr扩增 PCR反应总体系(25 μL):10×PCR缓冲液2.5 μL,dNTP(10 mM)0.5 μL,上下游引物(10 pmol)各1.2 μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL,DNA模板(50 ng/μL)1.2 μL,超纯水18.2 μL。 2 循环循环次数 94℃预变性5 min;94℃变性30 s,63～65℃退火30 s,72℃延伸1.0 min,进行34个循环;72℃延伸7 min;12℃保存。 1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶银染法 取PCR产物2 μL与上样缓冲液8 μL(95%甲酰胺,0.25%二甲苯青,0.25%溴酚蓝,EDTA 20 mmol/L)混匀,放入沸水煮沸10 min,立即取出冰浴30 min,取混合物于12%的聚丙烯酰胺凝胶180V电泳18 h后进行银染。 1.2.4 mc1r基因序列及比对 对SSCP技术检测出不同基因型的个体选用4条引物(MC1R1-F和MC1R3-R,MC1R3-F和MC1R5-R)进行扩增,然后对PCR产物进行双向测序,再进行比对和拼接,采用DNAMAN5.0软件对略阳乌鸡MC1R基因序列和NCBI公布的其他禽类MC1R基因进行比对,通过MEGA5.05软件,采用邻接法(NJ)、最大似然法(ML)构建略阳乌鸡在MC1R位点的系统进化树。 1.2.5 mc1r基因编码区序列及聚类方法 以略阳黑羽乌鸡、略阳麻羽乌鸡、略阳普通鸡的MC1R基因编码区序列和从NCBI选取的其他不同种属禽类的MC1R基因编码区序列为基本数据,采用UMPG、NJ、ME和ML4种方法进行聚类;通过MEGA5.0软件计算研究样本不同属间的遗传距离。 1.2.6 黑素皮质素受体结构的预测 采用全球蛋白质知识库中的专家蛋白分析系统(Experience protein Analysis Sytem,ExPASy),对略阳鸡不同类型黑素皮质素