hplc法同时测定小半夏汤中6-姜酚、6-姜醇的方法研究.docxVIP

hplc法同时测定小半夏汤中6-姜酚、6-姜醇的方法研究 小半夏汤来自张仲景的《缺钱要领》。它仅由半夏、生姜两种药物组成，但有良好的止吐效果。因此，历代医家都称赞它是“呕吐之药”。目前对其的研究主要集中在药理药效方面。本课题组前期的研究发现, 小半夏汤水溶性部位中含有多种具强烈生理活性的核苷类物质。该方中, 生姜虽为臣药, 但现代研究表明, 其中所含的姜酚、姜醇类物质为其止呕主要活性物质。因此本实验对该方中6-姜酚和6-姜醇进行了测定, 为全面研究小半夏汤作进一步的探索。 1 sartorisb211d型电子天平的表征 Waters2690型高效液相色谱仪, 996PDA检测器, Millennium 32色谱管理系统;Sartorius BP211D型电子天平。 甲醇为色谱纯, 水为亚沸蒸馏水 (自制) ;6-姜酚、6-姜醇对照品为由本实验室分离纯化制得的黄色油状物, 经UV、IR、MS、NMR等结构测定, 并经HPLC检测为单一成分, 质量分数达到99%以上;小半夏汤由南京中医药大学中医药研究院提供。 2 方法和结果 2.1 色度条件的确定 2.1.1 最大吸收波长的确定 采用紫外区全波长扫描的方法, 对6-姜酚和6-姜醇的最大吸收波长进行研究, 结果见图1。发现两者均在280 nm处呈现最大吸收, 因此确定了在280 nm进行测定的方法。 2.1.2 检测波长和测量流量 mm, 5 μm) ;流动相:甲醇-水 (65∶35) ;检测波长:280 nm;柱温:30 ℃;体积流量:0.8 mL/min。理论塔板数以6-姜酚计不低于4 000, 并且6-姜酚、6-姜醇与其他组分的分离度均大于1.5。 2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品贮备液的配制 分别取减压干燥至恒重的6-姜酚、6-姜醇对照品适量, 精密称定, 加甲醇溶解, 分别配成含6-姜酚6.365 mg/mL、6-姜醇2.22 mg/mL的对照品贮备液。 2.2.2 乙醇萃取法 精密吸取装量差异项下的本品约40 mL, 置150 mL分液漏斗中, 加入等量无水乙醚, 萃取两次, 取乙醚层, 蒸干, 残渣用甲醇溶解, 定量转移至25 mL量瓶中, 定容, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 即得。 2.3 溶液中峰面积的测定 分别精密吸取含6-姜酚6.365 mg/mL、6-姜醇2.22 mg/mL的对照品贮备液各0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mL置10 mL量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀, 制得系列混合对照品溶液。取10 μL进样, 测定峰面积。以进样质量对峰面积值作图, 回归分析, 结果6-姜酚在1.273~11.457 μg有良好的线性关系, 回归方程为Y=6.207×105X-1.998×104,r=0.999 9;6-姜醇在0.444~3.996 μg有良好的线性关系, 回归方程为Y=3.273×105X-2.278×104,r=0.999 8。 2.4 样品、对照品色谱条件考察 按处方比例制得缺生姜的阴性样品, 按供试品溶液的制备项下方法制备阴性样品溶液。按上述色谱条件分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液进样, 记录色谱图, 见图2。结果在与对照品色谱相对应处未出现色谱峰。表明按本实验条件, 处方中的其他成分不干扰6-姜酚、6-姜醇的测定。 2.5 峰面积积分值的测定 取供试品溶液 (批 1份, 重复进样6次, 进样量10 μL, 记录所测各组分峰面积积分值, 计算, 结果6-姜酚、6-姜醇峰面积积分值的RSD分别为1.54%、1.43%。 2.6 -姜酚和6-姜醇质量浓度的测定 取同一批样品 (批 6份, 制备供试品溶液, 依法测定, 计算各组分的质量浓度, 结果6-姜酚、6-姜醇质量浓度的RSD分别为0.43%、1.48%。 2.7 进样稳定性试验 吸取新配制的供试品溶液 (批 1份, 分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样, 测定6-姜酚、6-姜醇的峰面积, 结果其RSD分别为1.56%、1.41%, 表明供试品溶液在12 h内稳定。 2.8 加样回收率试验 分别精密吸取装量差异项下的批品约20 mL, 平行5份, 精密加入含6-姜酚1.498 mg/mL, 6-姜醇498 μg/mL的混合对照品储备液5.0 mL, 制备供试品溶液, 按上述色谱条件进行HPLC测定, 计算回收率, 结果6-姜酚的平均回收率为99.82%, RSD为1.40%;6-姜醇的平均回收率为100.30%, RSD为1.44%。 2.9 样品测定 取不同批号的小半夏汤制备供试品溶液。分别取供试品溶液和对照品溶液各10 μL进样测定, 以外标一点法计算质量浓度, 结果见表1。 3