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转基因技术在草坪草改良中的应用 传统的草坪业在过去40年中取得了巨大的发展。经过遗传特性的选择和重组,培育了大量的冷季型和暖季型草坪草。大约有40个草种已被用于草坪的建植,在不同的气候和土壤条件下美化我们的世界、丰富人类的多种需求。民居环境、城乡公共绿地、园林景区、高尔夫球场、运动场,乃至机场、公路堤岸等草坪都是十分重要的生态环境组成部分。在美国,草坪草草籽每年销量达5.8亿美元,仅次于玉米杂交种的销售额, 草坪业已成为一个十分重要的经济行业。 对草坪需求的增长和草坪草生境的变化,使国际草坪育种工作者纷纷提出,使用高新生物技术向草坪草引入新的遗传特性来创造新的草坪草品种。1998年《草坪草的生物技术》(Turfgrass Biotachnology)一书问世,书中比较全面地论述了从细胞水平和分子水平的技术运用来改良草坪草。 近年来拟南芥、水稻等植物基因组的研究进展十分迅速,大量的功能基因被发现,并大大推动了植物基因工程的发展。在草坪草的研究中,一些重要草坪草植株的再生技术和遗传转化技术取得了长足的进步。分子标记的辅助育种也展示了可喜的苗头[8,9,10,11,12,13,14,15,16]。 1 植物基因型的转化 许多草坪草是单子叶植物,其离体的再生系统建立比较困难,成熟的和已分化的组织难以产生具有再生潜力的细胞团。Vasil综合前人的研究成果提出了建立草类再生系统的3个要点:1)选择成熟胚的分生组织、叶基分生组织和幼穗分生组织作为外植体来诱导具植株再生潜能的细胞系;2)高浓度的生长素类物质,如2,4-D和3,6二氯-O-茴香酸来诱导愈伤组织;3)从胚性愈伤组织制备原生质体或其他再生系统。迄今为止,这3个要点仍然是草坪草基因改良的重要技术基础。 Dale首先从未成熟的意大利黑麦草Lolium multiflorum获得可进行胚性培育的细胞系,Chai 和 Sticklen概括了此前的重要进展。资料表明,黑麦草属、羊茅属Festuca、剪股颖属Agrostis、早熟禾属Poa、鸭茅属Dactylis、钝叶草属Stenotaphrum、狗牙根属Cynodon、蜈草属Eremochloa﹑雀稗属Paspalum、野牛草属Buchlo?﹑结缕草属Zoysia等重要的属种中,已有成功的再生体系,并找到从原生质体再生出植株的方法。这些工作为草类植物导入基因创造了必要的前提条件。茎端再生系统建立之后,转化技术仍有许多困难,在转化过程中,由于在培养基中施加了选择压力,大大限制了芽的分化和再生。 一些学者观察到草坪草组培过程中可能发生的基因型变异,这在其他种属的植物培养中也常遇见。这种变化在冷季型草类中更多一些。因为实际上的冷季型草类在遗传上是一种异质体(heterogeneous),这种变异因素在遗传转化研究中应充分考虑。在草坪草转化过程中,曾发现个别株系生长变得十分迅速,它虽不适于做草坪草,但这种性状的变化适合牧草(见彩插后页图1)。 2 胚性愈伤组织的诱导表达 Horn等人首次报道了转基因的鸭茅D.glomerata,Lee报道了6种冷季型草坪草转化成功。被导入的外源基因均是供转化选择的标记基因和报告基因,其中包括报告基因Gus,抗除草剂基因草丁膦乙酰转化酶基因(phosphinothricin acetyl transferase基因,即Bar基因)和潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase)基因。这些工作对优化转基因的程序十分重要。 DNA直接导入植物细胞的方法:1)选择成熟胚的分生组织、叶基分生组织和幼穗分生组织作为外植体来诱导具植株再生潜能的细胞系;2)高浓度的生长素类物质,如2,4-D和3,6二氯-O-茴香酸来诱导愈伤组织;3)从胚性愈伤组织制备原生质体或其他再生系统。包括借助电激作用或聚乙二醇的介导,将DNA直接引入原生质体,还包括基因枪法[42,43,44,45,46,47,48]和碳化硅(silicon carlide)纤维介导方法对草坪草胚性愈伤组织的转化。据在黑麦草、高羊茅、早熟禾、紫羊茅中的实践,认为在获得良好胚性愈伤组织的基础上,采用基因枪转化方法,转化频率还是比较高。图2(见彩插后页图2)是在实验室进行的对黑麦草的遗传转化和植株再生的过程。农杆菌介导的转化方法具有简便和导入拷贝数低等优点,近年由于农杆菌介导方法在水稻、玉米、小麦等单子叶作物的转化中得到较多的改良和实际应用,因此,草类转化中的农杆菌介导方法也将得到比较广泛的应用。 3 抗rondup基因在草坪草方面的应用 早期的工作主要是利用一些标记基因或报告基因来转化草坪草。这些工作使外源DNA整合到草坪草基因组中的技术趋于完善。Edminster指出,虽然至今尚无转基因的草坪草进入商业化生产,但有必要加速转基因草坪草的商业