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酶法提取鸡花青素工艺研究 太和鸡，又名丝毛鸡、毛鸡、白凤鸡、武象山，具有“冠、凤头、绿耳、胡子、丝毛、爪、足部、乌皮、乌肉、乌骨”等特点。它的外形是美丽的，有“十完整美”的理论。它发祥于泰和县武山汪陂涂村,至今已有2 200年历史。 乌骨鸡区别于其他鸡的显著特征是体内(特别是骨)黑色素分布广泛。《本草纲目》中记载:乌鸡的入药效果与乌鸡皮、骨、肉中的黑色素深浅有关,其颜色愈深者,入药愈佳。现代医学也认为乌鸡的药用价值和食用价值存在于体内黑色素物质中,乌鸡黑色素是滋补、强身健体、抗衰防老、颐养天年的物质基础。黑色素是一种不溶于水和几乎所有溶剂的生物高聚体。哺乳动物体内含有两种天然的黑色素,黑-棕色的真黑色素和黄-红色的脱黑色素。乌鸡黑色素属于真黑色素。真黑色素是一种复杂的多聚体,由5,6-二羟吲哚和5,6-二羟吲哚-2-羧酸和它们相对应的O-醌体杂合而成。 桑宏庆等对盐酸法提取乌鸡黑色素的工艺进行了优化,确定在料液比为1∶2(m∶V),40 ℃条件下浸提3次效果最佳,提取率可达0.373 6%。蔡华珍等研究酶法水解乌鸡蛋白质分离黑色素,结果表明,酸性蛋白酶为最优水解酶,其加酶量3.8%、固液比1∶2(m∶V);其最佳酶解条件为pH 2.8、酶解温度34.8 ℃、酶解时间20 h。但是对两种方法提取工艺优化以及比较研究未见报道。本试验以泰和乌骨鸡为原料,用单因素和正交试验比较研究酶法和盐酸提取法两种提取方法的最佳工艺、黑色素的提取率以及黑色素的稳定性等,以确定最佳的提取乌鸡黑色素的提取方法以及工艺条件。 1 材料和方法 1.1 试剂和仪器 泰和乌骨鸡:购于江西省泰和县乌骨鸡原种鸡厂,60～90日龄。活鸡运输,养殖于动物学院的动物饲养中心。 木瓜蛋白酶(酶活力≥100万U/g)、胃蛋白酶(酶活力 1∶3 000 U/mg)、碱性蛋白酶(酶活力10万U/g)、胰蛋白酶(酶活力1 000～1 500 U/mg):上海如吉生物科技发展有限公司; DPPH·:美国Sigma公司; 磷酸二氢钠、磷酸氢二钠:湖州湖试化学试剂有限公司; 无水乙醇、碳酸钠:国药集团化学试剂有限公司; 浓硫酸、浓盐酸:杭州大方化学试剂厂。 1.2 实验仪器 离心机:TD5A-WS,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司; 紫外光栅分光光度计:752,上海精密科学仪器有限 公司; 电热恒温水槽:DK-8D型,上海精宏实验设备有限公司 旋涡混合器:VORTEX-5,美国Scientific Industries 公司; 移液枪:4860型 ,德国Eppendorf公司; 电子天平:TE412-L,赛多利斯科学仪器(北京)有限 公司。 1.3 测试方法 1.3.1 提取黑驴的方法 (1) 液和氧化酶法 取经预处理的泰和乌鸡腿部肌肉50 g,绞碎,置于250 mL烧杯中,加入磷酸盐缓冲液和蛋白酶,在一定条件下,搅拌酶解4 h左右。酶解液于90～100 ℃保温处理20 min,然后于5 000 r/min离心20 min,弃去上清液,先后用石油醚、乙酸、蒸馏水等溶剂多次洗涤下层沉淀去除杂质,将沉淀真空冷冻干燥得到乌鸡黑色素粗品。 (2) 鸡激素的提取 取经预处理的泰和乌鸡腿部肌肉50 g,绞碎,置于250 mL圆底烧杯中,加入6 mol/L的盐酸浸泡12 h,90～100 ℃下冷凝回流2～3 h,流水冷却后,提取液于5 000 r/min离心20 min,弃去上清液,先后用石油醚、乙酸、蒸馏水等溶剂多次洗涤下层沉淀,去除杂质,将沉淀真空冷冻干燥得到乌鸡黑色素粗品。 1.3.2 采用酶法提取乌江黑色素的优化 (1) 蛋白酶种类对鸡氧化酶提取率的影响 固定酶底比为1∶25(m∶m),料液比为1∶2(m∶V),酶解时间为4 h。以木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶为考察对象,分别在各酶最适温度和pH条件下进行酶解试验,以黑色素提取率为评价指标,考察蛋白酶种类对乌鸡黑色素提取效果的影响。各蛋白酶的最适温度和pH见表1。 (2) 酶解时间及ph 以木瓜蛋白酶为水解酶,固定酶底比为1∶25(m∶m),温度为55 ℃,pH为5.5,酶解时间为4 h。分别在料液比为1∶1,1∶2,1∶3,1∶4,1∶5,1∶6(m∶V)的条件下进行酶解试验,以黑色素提取率为评价指标,考察料液比对乌鸡黑色素提取效果的影响。 (3) 酶解黄瓜蛋白酶 由于木瓜蛋白酶在pH 3～9.5时稳定,超过此范围,失活较严重,而木瓜蛋白酶的最适pH值为5.7,因此,在本试验中,以木瓜蛋白酶为水解酶,固定酶底比为1∶25(m∶m),酶解时间为4 h,温度55 ℃,料液比为1∶2(m∶V)。分别在pH值为5.0,6.0,7.0,8.0,9.0条件下进行酶解试验,以黑色素提取率为评价指标,考察pH对黑色素提取效果的影响。 (4)