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一株羊传染性脓疱病毒的分离鉴定及基因克隆 绵羊感染病毒（orf.v）是天花病毒科副痘病毒属的代表。它具有高度的嗜透性。这是各种动物（如山羊、豹子牛和蛇）感染的黄河的重要病理原因，主要导致山羊的感染。该病俗称“羊口疮(Sore mouth disease)”,是一种急性、接触性、嗜上皮性的人兽共患传染病,以在绵羊、山羊的唇部、鼻孔周围、口腔黏膜和乳房等部位皮肤形成丘疹、水疱、脓疱和疣状痂皮为特征,主要引起皮肤和黏膜的增生性变化。该病几乎存在于所有的养羊国家,常呈群发性流行。据资料报道其发病率可达50%左右,敏感羊群高达90%,因此该病的发生给养羊业带来了巨大的经济损失。我国内蒙、青海、甘肃、吉林等主要养羊省区也经常有该病发生和流行的报道。2008年11月,长春市郊一养羊户送检1只出现“口疮”的2月龄羔羊,为了查明病因,本试验进行了系统的病原分离鉴定。 F1L基因位于ORFV基因组中部,已证实其编码的F1L蛋白是病毒表面微管的组成成分之一,并且能诱导宿主产生中和抗体。此外,该蛋白具有肝素结合活性,能够与表达于大多数哺乳动物细胞表面的硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)受体结合,因此该蛋白被认为在病毒吸附和侵入过程中起到重要作用。为此本试验克隆了ORFV长春分离株(ORFV-cc)的F1L基因,通过测序分析,与GenBank中发表的ORFV-NZ2,ORFV-7,ORFV-20,ORFV-C2,ORFV-mi-90,ORFV-Torino株的F1L基因序列进行核苷酸和氨基酸的同源性比较和分析,借以了解ORFV-cc毒株F1L基因的分子特性以及其编码蛋白的功能,为进一步开展ORFV致病机制、新型疫苗、诊断预防等研究奠定生物学基础。 1 材料和方法 1.1 抗血清、igg和ssa MDBK细胞由本实验室保存;绵羊痘病毒(SPPV)由吉林省兽医科学研究所提供;兔抗ORFV抗血清由本实验室制备保存,间接ELISA检测血清效价为1∶128 000;FITC标记山羊抗兔IgG购自北京鼎国生物技术有限责任公司;DL2000 Marker、限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ、TaKaRa Ex-Taq DNA polymerase等购自大连宝生物公司。 1.2 病毒分辨率 1.2.1 pbs悬液的制备 采集患病羔羊唇部痂皮,加0.01 mol/L(pH7.2)PBS研磨制成1∶10的悬液,5 000 r/min离心30 min,取上清,按20%比例加入10 000 IU/mL的双抗(青、链霉素),4℃感作过夜后,-20℃保存备用。 1.2.2 细胞维持液制备 MDBK细胞长满单层后,弃上清营养液,接种1.2.1中的病料处理上清液1 mL,37℃吸附2 h;弃上清液后加入含2%血清的MEM细胞维持液,37℃静止培养。同时设正常细胞对照。每天观察细胞生长情况和细胞病变(CPE),若细胞在接种病料后4~5 d内未出现病变则连续盲传3代,若第5代仍未出现病变视为阴性,出现病变的反复冻融3次后收毒,置-20℃保存。 1.3 一般病毒学的鉴定 1.3.1 电镜观察观察 分离毒株盲传4代后,细胞培养物出现典型CPE,收集病变细胞液,-20℃反复冻融3次,3 000 r/min离心20 min,取上清用1%磷钨酸溶液进行电镜负染观察。 1.3.2 脂溶剂敏感试验和热稳定性试验 对待鉴定病毒进行理化学特征鉴定。用5-IUDR处理病毒液进行病毒核酸类型鉴定;用20%乙醚和5%氯仿处理病毒液进行脂溶剂敏感试验;50℃水浴30 min进行病毒耐热性试验。同时设立不作处理的正常对照组,分别用MDBK细胞在96孔板上测定病毒的TCID50。 1.3.4 小鼠痕接种及正常对照 收集病毒液经20 000 r/min超速离心6 h后,用纯化病毒液唇部划痕接种1只2月龄羔羊,接种量0.5 mL,同时设正常对照。接种后每天观察其接种部位的变化,待出现典型口疮病变后剖杀病羊,采集病变部位痂皮材料,一部分经10%中性福尔马林固定后进行病理组织学观察,另一部分于-20℃冻存备用。 1.4 病毒基因组dna的提取 根据GenBank中F1L基因序列,用Primer Premier 5.0软件设计引物,引物P1、P2的5′端分别引入了HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点(下划线标示),引物由上海生物工程有限公司合成。P1:CTAAAGCTTTACATA-ATCGGGGTTGCC;P2:CAGAATTCTCACAC-GATGGCCGTGACC。 用MiniBEST病毒DNA提取试剂盒提取病毒基因组DNA,操作按试剂盒说明书进行。以提取的病毒基因组DNA为模板,采用25μL的PCR反应体系:13.5μL灭菌水,2.5μL Ex-Taq Buffer,1.5μL dNTPs(2 mmol/