糖尿病大鼠缺血性心脏病模型的制备.docxVIP

糖尿病大鼠缺血性心脏病模型的制备 根据2007年至2008年中国科学和文化发展研究所的流行病学研究，20岁以上的中国青年糖尿病患者数量为9.7%，约14200万人。糖尿病 (diabetes mellitus, DM) 已成为我国必须面对的公共卫生问题。DM长期代谢异常能够引起多种并发症, 其中, 冠状动脉病变及其引起的缺血性心脏病已经成为糖尿病人死亡的主要原因。 目前, 多采用结扎冠状动脉前降支制备糖尿病心肌缺血模型, 但是该模型为心肌的急性损伤模型。而DM为慢性代谢性疾病, 其并发的缺血性心脏病也是一个缓慢致病的过程。因此, 制备慢性2型糖尿病大鼠心肌缺血模型, 对于其机制的研究具有重要意义。在本研究中我们采用高糖高脂饮食联合注射STZ制备的2型糖尿病大鼠, 观察其是否会发生糖尿病缺血性心脏病, 为糖尿病缺血性心脏病的研究提供理想的动物模型。 1 材料和方法 1.1 f级饲养环境适应周期 6周龄雄性SPF级Wistar大鼠, 体重 (150.2±7.2) g, 购于军事医学科学院实验动物中心。SPF级饲养环境适应一周, 环境温度为20～25°C, 12P12h昼夜规律。随机将大鼠分为2组:正常组 (Control) 10只;糖尿病模型组 (DM) 10只。正常组饲喂正常饲料, 糖尿病模型组饲喂高糖高脂饲料, 即由基础饲料按比例添加蔗糖, 炼猪油和蛋黄搭配制作 (蔗糖20%, 猪油10%, 蛋黄10%, 基础饲料60%) 。 1.2 实验试剂与仪器 链脲佐菌素 (streptozoticin, STZ, Sigma, USA) , 柠檬酸钠缓冲液 (Solarbio) , 大鼠胰岛素Elisa试剂盒 (上海西塘科技有限公司) , 大鼠心肌肌酸激酶试剂盒、大鼠心肌乳酸脱氢酶试剂盒 (南京建成生物工程研究所) , 强生稳豪倍易型血糖仪及配套试纸 (强生) , 高速低温离心机 (Thermo, USA) , 指针型三用电热恒温水浴箱 (北京市长风仪器仪表公司) , BL-410生物机能实验系统 (成都泰盟) , SpectraMax M3多功能酶标仪 (Molecular Devices, USA) 。 1.3 大鼠的一般情况,血糖高、体重和血糖 糖尿病模型组给予高糖高脂饮食4周后, 一次性腹腔注射40 mg/kg STZ (溶于0.1 mol/L柠檬酸缓冲液, p H 4.5) 。正常组给予正常饮食4周后, 腹腔注射等量柠檬酸缓冲液。注射STZ 48 h后测空腹血糖, 空腹血糖值11.1 mmol/L的大鼠为造模成功。1.4大鼠的体重和血糖测定 每周常规检测体重, 连续14周。每周定期检测血糖, 连续14周。空腹8 h后, 剪尾法采血, 强生血糖仪测定大鼠空腹血糖值。 1.5 血清分离时间 每周鼠尾静脉采集血液, 4℃离心, 3 000 r/min, 15 min, 分离血清, -20℃保存, 连续14周。采用酶联免疫吸附法, 使用SpectraMax M3多功能酶标仪测定血清胰岛素的含量。 1.6 心电图监测 糖尿病模型组大鼠和正常组大鼠每周定期心电图监测, 连续14周。麻醉, 固定, 使用BL-410生物机能实验系统, 测定肢体2导联心电图。 1.7 血清去清2.3.2 在第14周测心电图后, 各组大鼠腹主动脉采血。室温静止30 min, 3 000 r/min离心15min后, 分离血清, -20℃冻存备用。按试剂盒说明书, 使用SpectraMax M3多功能酶标仪测定血清中肌酸激酶和乳酸脱氢酶的含量。 1.8 统计分析 实验数据以均值±标准差 (±s) 表示, 所有数据使用SPSS 16.0统计软件分析处理, 组间比较采用独立样本t检验。 2 结果 2.1 糖尿病模型大鼠血糖变化 前4周, 糖尿病模型组大鼠的血糖与正常组相比, 没有明显差异 (P0.05) 。在第4周结束时, 注射STZ后, 糖尿病模型组血糖值迅速升高, 达到17.9 mmol/L, 与正常组之间血糖值具有显著差异 (P0.05) , 随后糖尿病模型组大鼠的血糖处于较高水平, 波动在16.3 mmol/L～18.7 mmol/L之间 (图1) 。 2.2 脂放养时间对脂喂胰岛素水平的影响 从胰岛素水平的变化来看, 高糖高脂饲喂的大鼠, 在第2周时开始升高, 随着高糖高脂喂养时间的延长, 胰岛素水平在不断提高, 在第4周胰岛素水平达4.05 ng/ml, 与正常组比较具有显著差异 (P0.05) 。当注射STZ后, 胰岛素含量迅速下降到1.92ng/ml。正常大鼠血清胰岛素含量未有明显变化 (图2) 。 2.3 血糖、体重变化 高糖高脂喂养组大鼠体重迅速增加, 在第2周, 与正常组大鼠体重之间有显著差异 (P0.05) 。第4周后, 随血糖进一步增加,