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糖尿病性心肌病（CD）是糖尿病慢性并发症中的一种特征性心肌病变。研究发现，miRNA在心血管疾病中发挥重要作用。本研究采用STZ诱导T1DM小鼠建立模型，运用基因芯片技术检测心肌组织中差异miRNA表达，旨在探讨miRNA在DC中的作用。实验结果显示，与对照组相比，模型组的心肌组织中miRNA表达存在差异，这有助于阐明miRNA在特定类型的细胞凋亡中的功能。此外，通过使用基因表达平台进行比值比较，我们可以更深入地理解miRNA在调控心脏结构、控制血流、影响炎症和免疫等方面的作用。这些发现有助
糖尿病小鼠心肌microrna的表达及差异靶基因的生物信息学分析
糖尿病性心肌病（cd）是糖尿病慢性并发症中的一种特征性心肌病变。研究［１－３］发现, microRNA (miRNA) 在心血管疾病中发挥重要作用。本研究采用STZ诱导T1DM小鼠建立模型, 运用基因芯片技术检测心肌组织中差异miRNA表达, 旨在探讨miRNA在DC中的作用。
材料和方法
一、 材料和模型的制备
1.主要试剂与仪器:STZ、TRIzol试剂 (Sig- ma) ;miRNA分离试剂盒 (miRNeasy mini Kit, Am- bion) ;HE染液 (BASO公司) ;基因芯片采用RT２miRNA PCR Arrays (Qiagen) ;OneTouchⅡ血糖仪 (强生) ;SpectrophotometerND-2000 (NanoDrop) ; 实时定量PCR仪 (ABI7900HT) ;微量移液器 (Ep- pendorf) ;BX51系统显微镜 (Olympus) ;2100生物分析仪 (Agilent) 。
2.分组及模型建立:8周龄雄性C57BL/6小鼠12只, 由美国查尔斯河动物中心提供, 体重23~ 25g, 采用随机数字表法分为模型组和对照组, 每组6只。模型组予单次腹腔注射150mg/kg STZ制备T1DM动物模型, 对照组予单次腹腔注射等量枸橼酸钠溶液。48 h后尾静脉检测血糖, 血糖 16.7mmol/L小鼠即为造模成功。成模6周后处死小鼠, 取心肌组织置于-80℃备用。
二、 pcr和基因表达检测
1.心肌组织学检查:取左心室心肌组织, 采用10% PBS中性甲醛固定液固定, 经脱水、清洗、石蜡包埋后制成切片, HE染色后采用光学显微镜观察心肌细胞形态学改变。
2.心肌组织总RNA提取及质量鉴定:按照TR- Izol试剂说明书步骤逐步提取各组心肌组织总RNA, 采用miRNeasy Mini Kit进行纯化, 获得miRNA。采用NanoDrop2000测定总RNA/miRNA吸光度A260和A280值, 根据A260值计算其浓度, 计算A260/ A280以检测其纯度。采用2100生物分析仪进一步检测总RNA/miRNA质量。
3.定量聚合酶链反应 (qPCR) 检测心肌组织B型尿钠肽 (BNP) 和组蛋白去乙酰化酶1 (Hadc1) mRNA表达:取2μg mRNA逆转录为cDNA, PCR体系20μl, 其中SYBR Green 10μl, 上游 (10μmol/L) 、下游引物 (10μmol/L) 各1μl, cDNA 1μl, ddH２O 7μl。 PCR扩增参数为95℃预变性10min, 95℃变性15s, 60℃退火1min, 扩增40个循环。扩增引物序列BNP上游5′-CTGCTAGACCACCTGGAGGA-3′, 下游5′- AAGCTGTTGCAGCCTA GTCC-3′, 扩增片段320 bp;Hdac1上游5′-AGTGTGTGGAGTTCGTGAAG- 3′, 下游5′-CTCATTAGGGATCTCTGTGTC-3′, 扩增片段135 bp;内参基因Rps16上游5′- AAGTCTTCGGACGCAAGAAA-3′, 下游5′-TT- GCCCAGAAGCAGAACAG-3′, 扩增片段148bp。 每个标本进行2个复管检测。
4.miRNA表达检测:利用RT２miRNA PCR Arrays Mouse Mifinder快速分析通路聚焦的miRNA分析板 (96孔板) , 利用基于SYBR? Green的实时定量PCR, 实现敏感且特异的miRN检测和表达谱分析。每个样本重复3次。 (1) cDNA合成。 根据总miRNA测定浓度, 每个样品取总miRNA 100ng, 使用RT２Easy First Strand Kit合成cD- NA, 反应体系10μl, 即1μl miRNA RT PrimerERC Mix, 2μl 5×miRNA RT Buffer, 1μl miRNA RT Enzyme Mix, 1μl miRNA Nucleotide Mix, 5μl RNase-free H２O。反应程序为37℃孵育2h, 95℃ 5min, 冰浴10 min, RNase-free H２O 10倍稀释。置于-20℃或直接用于下一步实验。 (2) miRNA检测。再将cDNA模板100μl与2×RT２SYBR Green qPCR Master Mix 1275μl, ddH２O补充至2550μl。将等体积混合液分配至96孔板中, 反应体系25μl。使用ABI 7900HT PCR仪器运行。 反应程序为95℃ 预变性10 min, 95℃ 变性15s, 60℃退火1
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