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贵州苗族线粒体cornl-cornl-cornl-v区串联重复序列9bp缺失频率分析 贵州是一个多民族地区。有17个拥有少数民族的民族，其中苗族人口最多，约占中国苗族人口的50%。苗族人群线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)9 bp序列缺失标记可能对追踪该民族人群的亲缘关系和迁移路线有所帮助。因为mtDNA 9 bp缺失是一个非常有价值的多态性位点,其标准序列是2个串联重复的9 bp序列(CCC CCT CTA),有3种突变型:长型(标准序列前有4个C加入),短型(仅有单拷贝9 bp序列,即9 bp缺失),3型(有3拷贝9 bp重复)。研究发现,mtDNA 9 bp缺失是亚洲人及起源于亚洲的人种的特征,其缺失频率呈现的地理趋势能很好地与史前该地区人类迁移路线相符,现将贵州3个地域苗族人群131例男性的mtDNA 9 bp缺失频率的检测分析结果报道如下。 1 数据和方法 1.1 男性个体血样 采集来自贵州从江岜沙、黔西沙井、威宁龙街等3个地域苗族人群131例男性个体血样,详见表1。所选对象均为当地健康居民,家系3代内为同一民族,彼此之间无亲缘关系。采样符合知情同意原则。血样均为EDTA-K2抗凝,-70 ℃暂存至提取基因组DNA。 1.2 提取、指定和标准偏差 按常规酚-氯仿法抽提基因组DNA,溶于TE;紫外吸收法定量后取少量统一标化浓度为50 ng/μL,-20 ℃保存备用。 1.3 pcr扩增及扩增 依据mtDNA修订的剑桥标准序列(revised cambridge reference sequence,rCRS),用软件Primer Premier5.0设计引物P1/P2(序列见表2)进行PCR扩增。25 μL PCR反应体系组成为:10×PCR buffer 2.5 μL,25 mmol/L MgCl21.5 μL,4×dNTP(每种2.5 mmol/L) 2.0 μL,10 μmol/L引物各0.4 μL,DNA聚合酶1.0 U,模板DNA 50 ng。PCR循环条件:94 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循环30次。PCR产物用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,银染后观察结果。 1.4 pcr扩增及测序 随机选取经PCR技术检测为标准型和9 bp缺失短型的样本各5例,用引物P3/P4(序列见表2)进行PCR扩增,产物由北京鼎国昌盛生物技术公司完成序列测定。 2 结果 2.1 种基因型的检测 经过PCR检测,131例样本的PCR反应产物的电泳图谱中只检测到2种基因型,分别为109 bp和100 bp(图1),分别对应标准型和9 bp缺失的短型。 产物片段大小分别为标准型、9 bp缺失短型。 2.2 b缺失扩增 结果显示:标准型扩增产物的核苷酸序列与相对应的剑桥序列一致,即存在2个串联正向重复的9 bp序列(CCC CCT CTA CCC CCT CTA),而9 bp缺失短型扩增产物只有1个拷贝的9 bp序列,即存在9 bp缺失。见图2(A、B均为反向测序图)。 2.3 mtda9bp缺陷频率 贵州岜沙、沙井、龙街3个地域苗族人群mtDNA 9 bp缺失频率见表3。 3 缺频率和缺失频率对贵州少数民族mcda9bc的影响 姚永刚等对中国多民族群体的研究发现,其缺失频率由南向北、沿海向内陆呈现递减的梯度分布。不同地区不同民族的mtDNA 9 bp缺失频率是各异的。本研究的3个苗族人群的缺失频率与台湾的高山族(41.46%)相比较低,与广州汉族的缺失频率相近(20.8%),而较中原民族如河南汉族的缺失频率高(15.88%)。北方的一些少数民族,如现代罗布人(8.3%)、维吾尔族(3.3%)、塔吉克族(1.43%)缺失频率均比本研究的这3个民族低,差异经统计学分析已达到显著水平(χ2=8.845,χ2=9.499,χ2=23.324,P0.05),同一地区的不同民族其mtDNA 9 bp缺失频率是有区别的,如前期本课题研究贵州地区蒙古族(9.6%)、羌族(7.7%)都低于本研究,并且差异有统计学意义(χ2=8.280,χ2=10.094,P0.05),水族与本研究的苗族平均缺失率相近,而瑶族的缺失频率高达58.2%,高于本文的苗族平均缺失频率,差异有统计学意义(χ2=17.972,P0.05);不同地区的同一民族其mtDNA 9 bp缺失频率也各异,广西苗族缺失频率为33.01%,高于本研究,但差异无统计学意义。而贵州不同地区的苗族缺失频率也是有所差别,本文3个地区的苗族缺失频率就有所差异,其中从江岜沙苗族与黔西沙井苗族的差异有统计学意义(χ2=5.623,P0.05)。苗族历史悠久,由于战争、政治、经济等原因,历史上曾经历过大幅度、远距离、长时期的迁徙。自秦、汉时期有苗族