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耳鲍精子发生的细胞学研究 精子发生是发育生物学研究的重要组成部分之一。对软体动物尤其是重要经济类型的软体动物的精子发生的研究，不仅可以加深对发育生物学的理解，丰富发育生物学的内容，而且可以为发展提供一些理论基础，对预防和繁殖以及人类疾病方面发挥重要作用。目前,国内外对腹足类软体动物精子发生的超微结构研究较多(柯才焕等,1992;郑曙明等,2000;应雪萍等,2002;严云志等,2004;Garreau de Loubresse,1971;Buckland-Nickset al,1976;Franzen,1979;Eckelbargaret al,1981;Parivar,1981),对鲍科动物精子发生的研究仅见于日本鲍(Shiroya,1984),耳鲍精子发生的研究未见报道。 耳鲍(Haliotis asinisna)隶属于软体动物门(Mullusca)、腹足纲(Gastropoda)、前鳃亚纲(Prosobranchia)、原始腹足目(Archaegastropoda)、鲍科(Haliotidae),是一种经济价值和营养价值高的贝类,与九孔鲍和杂色鲍相比,耳鲍具有生长速度快,死亡率低的优点,是很好的全人工繁殖推广品种。对耳鲍精子发生的超微结构进行研究,不仅可以了解耳鲍生殖生物学的相关知识,而且对耳鲍人工繁殖具有重要的指导作用。 1 超声切片机切片 实验用耳鲍样采自海南岛海域,活体解剖,快速取出精巢,切成小块,用2.5%戊二醛和1%锇酸双固定,梯度酒精脱水,Epon812渗透包埋,LKB-Nova超薄切片机切片,醋酸铀和柠檬酸铅双重染色,Joel-1010型透射电镜下观察、拍照。 2 结果 2.1 小鼠精子的分离纯化 精原细胞(spermatogonium)紧靠精巢生殖小管基膜,细胞呈近椭圆形,大小为6.0μm×3.9μm,胞质中线粒体少,高尔基体不发达;细胞核较大,大小为4.1μm×3.4μm,核质较分散,核中异染色质少且分布较均匀,核膜清晰(图1a)。 a.精原细胞和初级精母细胞,×4000;b.初级精母细胞,×8000;c.次级精母细胞,×6000;d.精细胞,×12000;e.分化早期的精细胞(箭头示核周腔),×15000;f.分化早期的精细胞,×15000;g.分化中期的精细胞,×15000;h.分化中期的精细胞,×20000;i.分化后期的精细胞,×15000;j.分化后期的精细胞,×20000;k.分化后期的精细胞(箭头示染色质缺失), ×15000;l.分化后期的线粒体和鞭毛,×40000;m.成熟精子(箭头示染色质缺失),×15000;n.成熟精子,×30000。 图中字母分别表示:精原细胞(Sg),初级精母细胞(PS),细胞核(N),线粒体(M),高尔基复合体(GC),内质网(ER),核糖体(R),溶酶体(L),内质网小泡(EV),前顶体颗粒(PAG),中心粒(C),前顶体(PA),顶体(A),顶体泡(AV),顶体下 腔(S),鞭毛(F),尾部(E),近端中心粒(PC),远端中心粒(DC),质膜(PM),双联体微管(DM)和中心微管(CM) 2.2 游离核型半织构细胞的基因型检测 初级精母细胞(primary spermatocyte)的细胞胞体稍有增大,细胞呈近椭圆形,大小为7.0μm×4.9μm。细胞核大小约为5.6μm×4.0μm,偏向细胞一极,核内染色质多数凝聚成小团块状散布于其中,核膜清晰(图1b)。胞质中游离核糖体丰富;线粒体数目增多,分布在细胞的一侧,并逐渐向细胞核后方聚积(图1a、b);胞质出现高尔基体、内质网和溶酶体,溶酶体的直径约为0.35μm,内容物较均一(图1b)。 2.3 dspermatocyte 初级精母细胞进行第一次成熟分裂后产生染色体减半的次级精母细胞(second spermatocyte)。次级精母细胞比初级精母细胞小,细胞大小约为6.0μm×3.6μm,核大小约为4.3μm×3.0μm。胞质内线粒体数量多,部分线粒体发生融合而呈扁囊状,部分线粒体仍呈初始的椭囊状(图1c)。 2.4 顶体颗粒及核型构化 精细胞(spermatid)是由次级精母细胞经减数分裂Ⅱ产生的,近圆形,大小约为3.9μm×3.4μm。核圆形或卵圆形,相对精原细胞、初级精母细胞和次级精母细胞而言最小,约为3.0μm×2.5μm,染色质丝状,较均匀地弥散分布。细胞中线粒体少,呈短棒状,内质网小泡增多,游离核糖体颗粒增加(图1d)。精细胞逐渐分化成熟形成精子,其过程较复杂,可划分成三个阶段。 分化早期:精细胞形状变得不规则。细胞核为圆形,部分核膜囊泡化,扩张成明显的核周腔,核内染色质由较均匀弥散状分布逐渐聚合成致密的团块状,相互连接,多数染色质贴附于细胞核膜内面,其余分布于核的中央,核内有许多空泡状的