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aqman实时定量逆转录-聚合酶链反应法检测登革病毒的比较 邓革命热主要出现在热带和亚热带地区。这是由邓革命病毒引起的广泛分布、发病多、有害的重要寄生虫。登革病毒为黄病毒科黄病毒属的成员,包括4个血清型(1~4型)。其基因组RNA具有感染性,长约11 000 bp,编码3种结构蛋白及7种非结构蛋白(NS1~NS5)。登革热可以以人为传染源,因此,准确、快速的诊断对于及早发现和管理传染源,对于控制登革热的流行具有重要意义。目前,登革热的病原学诊断有血清学方法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,前者在诊断的时效性和敏感性方面均不及后者。但传统的RT-PCR也存在操作时间长、容易出现假阳性结果等问题。实时定量PCR(realtime PCR)方法是一种省时且敏感性和特异性均较高的技术方法。为此,我们建立了Taq Man实时定量RT-PCR检测登革病毒,并与传统RT-PCR方法进行比较。现将结果报告如下。 1 材料和方法 1.1 观察样本的制备 登革病毒2型New Guinea C株(DV-2NGC株)由本室保存。使用前取1~3日龄的BALB/c乳鼠(南方医科大学动物中心提供),脑内接种0.03m L病毒悬液,每天观察2~3次,连续观察2~3周。接种后48 h内死亡的乳鼠弃去,视为非特异死亡。连续传3代,72 h后乳鼠开始出现拒乳、抽搐、侧卧、弓背;直至120 h,全部乳鼠临近死亡。无菌操作解剖取脑组织,加入1 m L DEPC处理过的三蒸馏水用无菌玻璃研磨器充分研磨,3 000 r/min离心15 min,上清液即为待检测标本,-70℃保存。 作为对照的乙型脑炎病毒株(本室保存)同上法处理,已灭活的西尼罗病毒由我校生物技术学院黎诚耀教授惠赠。 1.2 病毒rna的提取 采用QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit核酸提取试剂盒,按试剂盒说明书提取病毒RNA。取140!L检测标本液与buffer AVL-carrier RNA充分混合,吸附至硅胶上。然后分别用buffer AW1、AW2将杂质及多余的裂解液从硅胶上洗脱,最后用40!L buffer AVE洗脱硅胶上的病毒RNA,置-70℃保存备用。 1.3 基因片段聚合酶链反应taacctort 常规RT-PCR引物设计参照文献报道,针对NS1基因区域设计1对通用引物,所用的引物序列为,forward primer:5′-GTGCACACATG GACAGAACA-3′,reverse primer:5′-CTTTCTATCCAA TAACCCAT-3′,扩增目的基因片段长度为539 bp,由上海生工合成。Taq Man实时定量RT-PCR所用的引物和探针序列为,DENQ-F(NC):5′-AAGGACTAGAGGT TAGAGGAGACCC-3′;DENQ-R(NC):5′-CGTTCTGTG CCTGGAATGATG-3′。Probe Taq Man,DEN-P:5′-(Hex)TCTGGTCTCTCCCAGCGTCAATATGCTGTT(BHQ-2)-3′(由黎诚耀教授设计),交由大连TAKARA公司合成。 1.5 荧光探针pcr反应 Taq Man实时定量RT-PCR第一步(RT):总RNA 8!L,random hexamers 1!L,10 mmol/L d NTP mix 1!L。65℃5min,然后冰浴至少1 min。每管加入10×RT buffer2!L,25 mmol/L Mg Cl24!L,0.1MDTT 2!L,RNase OUT(40 U/!L)1!L,Super ScriptⅢ(200 U/!L)1!L。25℃10 min,然后50℃50 min,85℃5 min停止反应,立刻冰上放置至少5 min,最后每管加入1!L RNase H,37℃20 min即得到c DNA。第二步(PCR):PCR试剂采用Ta Ka Ra公司的Pemix Ex Taq Perfect RealTime。25!L反应体系配制如下:2×Premix Ex Taq12.5!L,Forward Primer(10Um)0.5!L,Reverse Primer(10Um)0.5!L,荧光探针溶液1.0!L,50×ROX Reference DyeⅡ0.5!L,DNA模板5.0!L,dd H2O5.0!L,反应条件:95℃10 s,95℃5 s,60℃20 s。共40个循环。检测仪器为Stratagene公司的Mx3000P。标本扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值(Ct值),以Ct值35判断为实时定量PCR阳性。 1.6 检测两种方法的特异性 Taq Man实时定量RT-PCR与普通RT-PCR方法同时对登革病毒、乙型脑炎病毒和