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nep1-40基因修饰的神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠行为学恢复的影响 神经干预（iuc）移植是对脊柱损伤最具前景的研究方向，但单纯移植后细胞存活率低，以及局部微环境中nogo蛋白等因素的存在严重限制了新轴突生长。NEP1-40多肽作为Nogo蛋白的拮抗剂能间接促进新生轴突的生长, 已成为目前国内外研究的热点, 但是单独运用也存在诸多不足。由此, 本研究从基因工程角度出发, 在体外制备NEP1-40基因修饰的NSC并移植到大鼠脊髓损伤区, 观察细胞移植后大鼠行为学功能的恢复情况, 以期为NSC移植治疗脊髓损伤提供一种新的思路。 1 材料和方法 1.1 动物和主要试剂、仪器 1.1.1 实验动物及设备 清洁级孕18 d Sprague-Dawley (SD) 大鼠1只及成年雌性SD大鼠40只, 体质量245~268 g, 平均250 g, 由四川大学华西动物实验中心提供 (动物许可证号:No.scxk[chuan]2004-14) 。本实验过程中对动物的所有处理均符合科技部《关于善待实验动物的指导性意见》之规定。 1.1.2 培养基和培养方法 胎牛血清 (上海微科生化试剂公司) ;重组人表皮生长因子 (h EGF) 、重组人碱性成纤维细胞生长因子、肝素、神经干细胞基础培养基 (Neuro Cult#174;NS-A Basal Medium) 、神经干细胞完全培养基 (Neuro Cult#174;NS-A Proliferation Supplements) 、神经小球分散试剂盒 (Neuro Cult#174;Chemical Dissociation Kit Product Description) (美国Stem Cell公司) ;兔多克隆抗体巢蛋白 (Nestin) (美国Proteintech group公司) , IGO750细胞培养箱 (美国Thermo Electron Corporation公司) ;GX51倒置相差显微镜、BX51TF荧光显微镜 (日本Olympus公司) , 5μL微型注射器 (北京英伟达科技公司) 。 1.2 实验方法 1.2.1 慢病毒转染质粒的构建 本研究中我们采用在前期研究中已成功构建的NEP1-40基因慢病毒表达载体。聚合酶链式反应 (PCR) 产物经电泳分析表明成功获取NEP1-40基因c DNA克隆, 测序提示慢病毒转染质粒连接构建正确;蛋白质印迹法显示NEP1-40在293T细胞内稳定表达。 1.2.2 细胞培养和转染 脱颈法处死孕18 d SD大鼠后, 取出子宫置于预冷的0.1%磷酸盐缓冲液浸泡5 min, 取出胎鼠并在显微镜下分离出两侧大脑皮层, 转移至含预冷NSC完全培养基的培养皿内制成细胞悬液后用200目滤网过滤, 静置5 min后弃上清液, 细胞重悬于NSC完全培养液 (基础培养基与扩增添加物混合比例为9︰1) , 培养基中加入h EGF (20 ng/m L) 、碱性成纤维细胞生长因子 (10 ng/m L) 、肝素 (2μg/m L) 、链霉素 (100μg/m L) 及青霉素 (100μg/m L) , 活细胞计数后按1×106/L的密度接种于75 cm2培养瓶中, 置于37℃、5%CO2孵育箱培养, 每3天半量换液。细胞传代后取第3代细胞进行病毒转染:800 r/min离心5 min (离心半径15 cm) 后弃上清液收集神经球, 加入神经小球分散剂获取NSC单细胞悬液, 按每孔1×105个细胞接种于6孔培养板内, 于37℃、5%CO2孵育箱内培养, 转染时先按感染复数值=10计算所需加入病毒载体的体积, 用计算出的NEP1-40慢病毒载体转染密度为1×107的NSC, 轻轻混匀, 置于37℃、5%CO2培养箱中过夜培养, 24 h后重复感染1次。48 h后观察荧光表达情况, 同时进行反转录 (RT) -PCR及蛋白质印迹法检测。 1.2.3 手术方法及分组 40只雌性SD大鼠经切除第8~10胸椎椎板显露硬脊膜:10只在切除椎板后用生理盐水冲洗创面并关闭切口, 即假手术组, 余30只在第9胸椎水平进行脊髓右侧半切后间断缝合硬膜并关闭切口。术毕放置在40℃恒温加热垫上直至完全苏醒后放回原笼。30只脊髓半切大鼠在手术7 d后随机分为3组, 每组各10只:脊髓损伤组、神经干细胞移植组 (NSC组) 和NEP1-40基因修饰神经干细胞移植组 (NEP1-40-NSC组) 。沿原切口显露受损脊髓节段后采用局部多点注射法, 在3组大鼠脊髓损伤部位用微量注射器分别植入5μL细胞培养液、NSC悬液及NEP1-40-NSC悬液 (浓度约为1×105个细胞/μL) , 注射位置在距离损伤处头尾侧各约2 mm处, 注射速度为0.5μL/min, 注射完毕后留针10 min, 缝