分子生物学第章分子生物学研究方法下.pptVIP

从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的转录因子示意图。 6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 本文档共63页；当前第28页；编辑于星期三\2点6分 真核生物转录调控因子具有组件式结构 （modular）特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中DNA结合结构域（binding domain，BD）和转录激活结构域（activation domain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。 单独的BD能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录；而由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。 6.3.2 酵母双杂交系统 6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 本文档共63页；当前第29页；编辑于星期三\2点6分 酵母双杂交的基本原理示意图 6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 本文档共63页；当前第30页；编辑于星期三\2点6分 a. 选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株 b. 研究的猎物(或称靶蛋白)蛋白的基因与编码AD的序列结合 c.诱饵(bait)蛋白的基因与编码BD的序列结合,形成两段融合基因 d. 将共转化的酵母菌株涂布于选择培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白（激活报告基因表达）的阳性菌落。 酵母双杂交主要实验过程： 6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 本文档共63页；当前第31页；编辑于星期三\2点6分 酵母双杂交系统的应用： 发现新蛋白和蛋白的新功能 研究抗原和抗体的作用（细胞内） 筛选药物的作用位点 建立基因组蛋白连锁图 6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 本文档共63页；当前第32页；编辑于星期三\2点6分 6.3.3 体外蛋白质相互作用技术 Far Western印迹技术 GST融合蛋白沉降技术 蛋白质芯片技术 等离子表面共振技术 免疫共沉淀技术 6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 本文档共63页；当前第33页；编辑于星期三\2点6分 Far Western印迹技术 用32P标记的体外表达蛋白作探针,直接检测与该蛋白发生相互作用的蛋白或表达该蛋白的cDNA。 6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 本文档共63页；当前第34页；编辑于星期三\2点6分 利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白。 GST融合蛋白沉降技术 6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 本文档共63页；当前第35页；编辑于星期三\2点6分 GST 融 合 蛋 白 沉 降 技 术 本文档共63页；当前第36页；编辑于星期三\2点6分 蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的 相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质 芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可 以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相 互作用蛋白点。 蛋白质芯片技术 6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 本文档共63页；当前第37页；编辑于星期三\2点6分 蛋白质芯片的制备 本文档共63页；当前第38页；编辑于星期三\2点6分 将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米级厚度的金属膜上。当蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，导致共振角度的改变。 等离子表面共振技术 6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 该技术不需要标志物和染料，安全灵敏快速， 还可定量分析。缺点是需要专门的仪器。 本文档共63页；当前第39页；编辑于星期三\2点6分 等离子表面共振技术示意图 6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 本文档共63页；当前第40页；编辑于星期三\2点6分 将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。 免疫共沉淀技术 6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 本文档共63页；当前第41页；编辑于星期三\2点6分 免 疫 共 沉 淀 示 意 图 6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 本文档共63页；当前第42页；编辑于星期三\2点6分 FRET荧光能量转移有三个基本条件： ① 给体与受体在合适的距离（1～10 nm）； ② 给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定 的重叠（这是能量匹配的条件）； ③ 给体与受体的偶极具有一定的空间取向 （这是偶极-偶极耦合作用的条件）。 6.3.4 细胞内蛋白质相互作用研究—— 荧光共振能量转移法（FRET） 6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 本文档共63页；当前第43页；编辑于星期三\2点6分 荧光共振能量转移