脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠水通道蛋白1、3、4、5表达变化.docxVIP

脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠水通道蛋白1、3、4、5表达变化 急性肺损伤（ali）是一种临床综合征，具有透水性肺水肿。目前，其发病机制尚不完全清楚。以往人们普遍认为,肺水肿主要是由于肺微血管内皮细胞(LMECs)受损所致,而对肺组织存在的水通道蛋白(AQPs)在病理生理条件下的作用认识不足。水通道蛋白(AQPs)作为膜主体内在蛋白(major infrinsic protein,MIP)家族成员,具有增加细胞膜水通透力的功能,可以提供快速液体转运的途径。目前为止,AQPs在ALI或肺部炎症中作用的研究主要集中在AQP-1和AQP-5,对于AQP-3和AQP-4的相关研究较少。另外,对于ALI后AQPs在肺组织中的表达增高还是降低,目前仍然有争议; 大多数的实验研究表明ALI后AQPs表达下降,但近期Lai等应用细胞模型发现炎症因子可以促进AQP-1的表达,Jang等在博来霉素导致的肺损伤中发现AQP-5表达出现上调。为此,本研究主要从基因和蛋白质水平观察内毒素(LPS)致小鼠ALI时AQP-1、AQP-3、AQP-4和AQP-5表达的变化,进而探讨肺生理及病理条件下急性肺水肿与AQPs之间的关系。 1 材料和方法 1.1 试剂和试剂盒 成年雄性C57BL/6小鼠,平均体质量20 g,由复旦大学上海医学院实验动物中心提供;LPS购自Sigma公司;抗AQP-1、AQP-3、AQP-4和AQP-5抗体购自Chemicon公司;SP试剂盒和DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司;TRIzol试剂购自Invitrogen公司;逆转录酶购自Promega公司;SYBR Green购自ABI公司;免疫印迹试剂盒购于康成生物公司。 1.2 动物模型制备 40只健康雄性的C57BL/6小鼠随机分为LPS 4 h组、LPS 6 h组、LPS 8 h组、LPS 10 h组和对照组,每组8只。LPS各组经气管内滴注脂多糖(LPS) 5 mg/kg(溶于生理盐水,4 ml/kg),而后将小鼠直立,垂直旋转小鼠,使药物均匀分布,从而建立内毒素性ALI动物模型,分别于造模后4 h、6 h、8 h和10 h收集样本。对照组经气管内滴注生理盐水(4 ml/kg)。 1.3 肺湿地干质量比 小鼠眼球放血致死后,暴露气管并开胸,观察肺形态。取右肺下叶称湿质量后置于60℃恒温箱,72 h后称干质量,计算肺湿/干质量比值。 1.4 肺组织病理学形态的观察 取左肺经4%多聚甲醛内、外固定后进行脱水、石蜡包埋, 5 μm厚切片,H-E染色观察。 1.5 免疫总pbs确定 采用SP法,切片经常规脱蜡、水化后,用3%过氧化氢去除内源性氧化酶,微波抗原修复,余步骤按试剂盒说明书进行。用已知阳性片作为阳性对照,以PBS 代替一抗作为阴性对照。AQP-1,3,4,5抗体稀释浓度为1：400。细胞胞质呈棕黄色着染者为阳性表达细胞。 1.6 逆转录合成cdna 检测肺组织AQP mRNA表达 取右肺中叶组织,采用TRIzol试剂参照说明书提取总RNA,取2 μg RNA逆转录合成cDNA,其中2 μl cDNA为模板扩增,PCR仪为ABI PRISM 7900,肌动蛋白β-actin为内参照,并设阴性对照。反应条件相同。引物序列见表1。 1.7 sds-table蛋白电泳 取右肺上叶组织,常规提取肺组织蛋白质,BCA法定量,取20 μg样品加入等体积的2×SDS样品缓冲液,沸水煮5 min,进行SDS蛋白电泳。其后转移至PVDF膜,按免疫印迹试剂盒说明步骤操作。暗室曝光、显影后用凝胶成像机测灰度,取均值。 1.8 统计处理 数据用xˉ±sxˉ±s表示,应用SPSS11.0统计软件对各组数据进行单因素方差分析。 2 结果 2.1 组量比值 4 h、6 h、8 h、10 h 组肺湿/干质量比值 (4.39±0.19、4.58±0.17、4.87±0.21、5.28±0.16)明显高于对照组(3.99±0.25,P0.05)。 2.2 肺组织的一般观察 LPS损伤各组肺脏均有不同程度的肿胀,表面可见暗红色点状病灶,切面可有淡红或白色泡沫样液体溢出。对照组未见上述改变。 2.3 中性细胞水浸法 对照组肺组织结构清晰,间质血管无明显充血,肺泡腔内未见中性粒细胞浸润;LPS损伤组肺间质增厚,肺泡结构破坏,肺泡腔内炎性细胞浸润和大量均质红染样渗出物(图1)。 2.4 两组肺组织aqp-1蛋白表达水平比较 对照组正常肺组织表达高水平AQP-1蛋白,染色呈棕黄色颗粒,可见在气道周围毛细血管和肺泡毛细血管内皮细胞上呈明显棕黄色分布;LPS损伤模型组肺组织AQP-1蛋白表达显著下降,可见AQP-1的染色与对照组相比变浅。对照组正常肺组织表达高水平AQP-5蛋白,染色呈棕黄色颗粒,可见在Ⅰ型肺泡上