骨碎补总黄酮对nf-介导成骨细胞增殖和凋亡的影响.docxVIP

骨碎补总黄酮对nf-介导成骨细胞增殖和凋亡的影响 骨碎补可用于治疗风疹、骨关节炎和骨质疏松症。骨碎补总黄酮是中药骨碎补有效成分的提取物。目前临床开发应用的中成药强骨胶囊其成分即为骨碎补总黄酮,具有补肾、强骨和止痛的作用,用于肾阳虚所致的骨痿。研究表明骨碎补总黄酮具有抗炎作用,能够减轻Ⅱ型胶原诱导的小鼠关节炎的程度。但骨碎补总黄酮治疗肾阳虚类风湿关节炎骨质疏松症的作用机制并不明确,本研究通过体外实验探讨其防治类风湿关节炎骨质疏松症的可能机制。 1 材料和方法 1.1 实验动物 1.3 骨碎补总黄酮含药血清的tnf-诱导的诱导增殖作用实验 1.3.1 成骨细胞的培养和鉴定 成骨细胞培养及鉴定参照相关文献。将新生24 h的Wistar大鼠处死后放入75%酒精中浸泡10 min,无菌揭去头皮,取下颅盖骨,清除表面结缔组织,用生理盐水冲洗至发白,剪碎,0.25%胰蛋白酶5 mL预消化20 min,弃消化液,骨片移入另一含0.1%Ⅰ型胶原酶的消化液中消化60 min,弃消化液,将骨片再次用0.1%Ⅰ型胶原酶消化60 min,过滤后的消化液280×g离心5 min,弃上清,沉淀的细胞加入5 mL培养液,接种至培养皿中,放入37 ℃、5% CO2培养箱内培养。24 h左右换液一次,去除不贴壁的死亡细胞,以后每2～3天换液一次,半汇合后传代。用碱性磷酸酶和茜素红钙结节染色对成骨细胞进行鉴定。碱性磷酸酶染色观察成骨细胞胞浆中出现蓝黑色颗粒或块状沉淀。茜素红钙结节染色观察可见红色钙结节。 1.3.2 含药血清的制备 Wistar大鼠20只随机分为空白对照组(蒸馏水灌胃)和骨碎补总黄酮组(强骨胶囊灌胃)。大鼠口饲给药剂量均按人日用临床剂量,经人-大鼠体表面积比值折算,每只大鼠每日强骨胶囊给药剂量为75 mg。每日给药2次,2 mL/次,连续给药3 d。末次给药1 h后,心脏采血并分离血清(1 120×g离心20 min),同组混匀,56 ℃、30 min灭活,经0.22 μm滤膜抽滤除菌,-20 ℃保存备用。参照相关文献及预实验结果确定给药剂量。 1.3.3 骨碎补总黄酮含药血清在TNF-α介导下对成骨细胞增殖作用的影响 第3代成骨细胞调整浓度为2×104个/mL,以100 μL/孔接种于96孔培养板,含2%胎牛血清培养液饥饿培养24 h后,分为6组:(1)20%空白血清组,(2)20%骨碎补总黄酮含药血清组,(3)20%空白血清组,(4)20%骨碎补总黄酮含药血清组,(5)20%空白血清+30 ng/mL TNF-α组,(6)20%骨碎补总黄酮含药血清+30 ng/mL TNF-α组。每组8孔,37 ℃,5% CO2培养箱中培养24 h后,(3)、(4)两组再分别加入30 ng/mL TNF-α(TNF-α根据参考文献及预实验结果选取30 ng/mL为实验浓度),所有6组继续放置于37 ℃,5% CO2培养箱中培养24 h;弃100 μL培养液后,加10 μL噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)(购自瑞士Fluka公司)溶液(5 mg/mL),37 ℃孵育4 h;弃上清,每孔加150 μL二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(购自美国Sigma-Aldrich公司)溶解结晶,置酶联免疫检测仪上(美国BIO-RAD680公司)测定吸光值(波长570 nm)。 1.3.4 骨碎补总黄酮含药血清在TNF-α介导下对成骨细胞凋亡的影响 取第3代的成骨细胞,经0.25%的胰蛋白酶消化后,反复吹吸使成单细胞悬液;调整细胞浓度为2×104个/mL,接种于12孔细胞培养板中,每孔1.5 mL,37 ℃、5% CO2培养箱内培养24 h;吸净孔板里的培养液,更换成1%胎牛血清培养液饥饿12 h;吸净孔板里的培养液,更换成20%空白对照血清、20%骨碎补总黄酮含药血清、20%骨碎补总黄酮含药血清+30 ng/mL TNF-α、20%空白对照血清+30 ng/mL TNF-α,每组3孔,培养48 h后,用Annexin V+碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色后,流式细胞技术(FACSCalibur HF16, USA)检测。 1.3.5 骨碎补总黄酮含药血清在TNF-α介导下对成骨细胞Bcl-2和Bax mRNA表达的影响 (1)取第3代的成骨细胞,经0.25%胰蛋白酶消化后,反复吹吸使成单细胞悬液;调整细胞浓度为2×104个/mL,接种于12孔细胞培养板中,每孔1.5 mL,37 ℃、5% CO2培养箱内培养24 h;吸净孔板里的培养液,更换成1%胎牛血清培养液饥饿12 h;吸净孔板里的培养液,更换成20%骨碎补总黄酮含药血清+30 ng/mL TNF-α或20%空白对照血清+