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云南大叶种和福鼎白毛茶茶氨酸含量的rapd分析 云南茶叶资源丰富，全国茶叶资源博物馆威海云南办事处保存了800多份茶叶资源。在茶叶资源研究中，传统的生物学观测方法、生理生化分析和细胞遗传等都发挥着重要作用。但也存在不足,茶树为多年生异花授粉、自交不育且高度异质化的多年生植物,许多性状如形态学、生物化学和生理学指标因受环境的影响而呈现出连续性变异或高度的可塑性,大多数形态学指标甚至受个体发育阶段的影响,呈现出错综复杂的形态,这就给种质性的正确鉴定和亲缘关系的确定带来困难。RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA,随机扩增多态性DNA)技术是由WILLIAMS等和WELSH J等(1990)首先创立的一种DNA分子标记技术,RAPD技术具有快速、简便、通用性好,对DNA的需求量小,质量要求低等优点。一经问世,就受到广泛的关注,并被成功应用于植物、动物、人和微生物的遗传多样性检测、基因定位、品系鉴定、遗传图谱构建、系统学研究等。RAPD技术的诞生为解决茶树种质的正确鉴定和亲缘关系的鉴定提供了新的途径。在茶树遗传多样性分析、亲缘关系分析、基因定位上已有相关报道,充分证明RAPD技术在茶树遗传多样性分析的可行性。 茶氨酸是茶叶的一个重要内含成分,是决定茶叶品质的关键因子,学名为N-乙基-γ-L-谷氨胺(Methy-γ-L-glutamine),分子式为C7H14O3N2,分子量为174,在茶汤中溶出率为80%,茶氨酸本身是茶汁呈鲜甜味的主要因子,它与绿茶品质等级呈显著正相关,相关系数为0.787~0.826,同时也是评价红茶的重要因子。在开展了42个茶树杂交品系样品液的茶氨酸含量分析的同时,进行了茶树高茶氨酸RAPD多态性引物筛选研究,能为选育和鉴定高茶氨酸茶树品种提供有用的RAPD分子标记,结果报道如下。 1 材料和方法 1.1 材料表面 供试材料为种植在国家茶树种质资源圃勐海分圃杂交园的云抗10号和福鼎大白茶的F1代42品系,取新梢保存于-70 ℃备用。 1.2 方法 1.2.1 茶氨酸法 1.2.1. 标准氨基酸混合液的制备 (1) 18种组分混合氨基酸标准液的配备,采用TAKARA KOSAN有限公司生产的氨基酸标准混合液配制。即吸取此标准液1.2 mL,用0.02 N盐酸稀释定容至50 mL,即得标准氨基酸混合液。(2) 茶氨酸标准溶液的配制:称取茶氨酸晶粉17.4 mg,用0.02 N盐酸溶解并定容至100 mL,取3 mL用0.02 N盐酸稀释定容至50 mL,即得茶氨酸标准液。(3) 氨基酸与茶氨酸混合标准液的配制:取上述A和B的标准液以不同比例混合配制而成。 1.2.1. 待测样品液的制备 精确称取恒重的茶样0.5 g,用蒸沸的蒸馏水50 mL浸泡15 min,并间歇搅拌数次。用脱脂棉过滤,滤液收集于50 mL容量中,茶渣继续用蒸馏水蒸煮,反复操作4次以上,合并所有的茶汤,定容在50 mL容量瓶中,用移液管量取2 mL茶汤,加入2 mL磺基水杨酸,定容于5 mL容量瓶中,静置30 min,取上清液50 mL,即为待测标准样品液。 1.2.1. 茶氨酸的标准样和生物降解 标准液的分析 , 用835-50型氨基酸分析仪已配制好的蛋白水解液分析的标准程序对A标准液进行18种组分的分离和测定;茶氨酸标准样的分析:用标准液B在专用程序进行茶氨酸的分析和测定; 42个品系茶汤样品中各种氨基酸的测定:取50 μL样品液在专用程序进行测定。 1.2.2 dna的分离纯化 取茶叶新梢0.5 g, 于研钵中加入液氮磨为粉末,加2 mL提取液(0.4 mol/L葡萄糖,3%可溶性PVP,10 mol/L Lb巯基乙醇),研磨成糊状移入5 mL离心管中,10 000 r/min离心10 min沉淀再用2 mL提取液悬浮,10 000 r/min离心10 min,沉淀再用2 mL裂解液(0.1 mol/L Tris pH 8.0,10 mmol/L EDTA, 0.5 mol/L NaCl, 1.5%SDS)裂解,65 ℃保温1 h,加入2 mL氯仿∶异戊醇∶乙醇(80∶4∶16,V∶V∶V)混匀,室温静置10 min,10 000 r/min离心10 min;上清液转入新5 mL离心管中,加入等体积异丙醇,混匀放置15 min,用玻棒钩出DNA絮团,无菌滤纸吸干,转入0.5 mL TE中(10 mol/L Tris pH 8.0, 1 mmol/L EDTA pH 8.0)中,加入到等体积酚∶氯仿混匀,12 000 r/min 离心10 min,上清液转入1.5 mL离心管中,加入1/10体积3 mol/L NaAc(pH 5.2)及2倍体积乙醇,-20 ℃放置30 min;用玻棒钩出DNA,70%乙 醇