琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)资料解读.docxVIP

琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)| 琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)| 琼脂稀释法 琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至 50℃左右的定量 MH 琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长 的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC 测定， 结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。 培养基制备 使用 MH 琼脂，按商品说明书进行配制，pH7.2~7.4。淋病奈瑟菌使用GC 琼脂基础加 1%添加剂；其它链球菌使用含 5%（V/V）绵羊血的 MH 琼脂（当试验磺胺药时，使用溶解的马血）。 含药琼脂平板制备 根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在 45~50℃水浴中平衡的MH 琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度 3~4mm。通常按 1∶9 比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中， 置 2~8℃冰箱可贮存 5 天。 接种物制备与接种 制备浓度相当于 0.5 麦氏标准比浊管的菌悬液，再1∶10 稀释，以多点接种器吸取制备好菌液（约1~2μl）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU，形成直径为5~8mm 的菌斑。接种好后置 35℃孵育 16~20h（甲氧西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌孵育时间应满24h），观察结果。奈瑟菌属、链球菌属细菌置 5%二氧化碳、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。 结果判断 将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制 80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。 如果出现有 2 个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。 原理： 将 抗茵药物配制到琼脂培养基中成： 1 28 u g /m l 、64 u g/m l 、32 u g /m l . .. . . ． 贰 0. 06 u g/ ml 对倍稀释的浓度系列 多点接种器将制备好的细菌菌悬液迅速点种到琼脂表面，经35 °C 16·- 2 0小时培养 肉眼观察细茵生长，以未见细菌生长平板的 最低药物 浓度为最低抑菌浓度(MI C) 抗菌药物保存液的准备1 估算抗菌药物最小称量 琼脂稀释法最高药物浓度 为128 u g/ml 药物和培养基的体积比1: 14，即 药物浓度将成 15倍稀释， 因此保存液为 128 u g/ml Xl.5 = 1920 u g/ml 如果1次用量为10ml ，则： 抗菌药物最小称量＝ 1920ug/m1*10ml 抗菌药物的效价 抗菌药物保 存液的准备2 抗菌药物稀释 选择合适的抗茼药物稀释液进行药物稀释， 稀释液需要量见下列公式： 抗菌药物实际称量＊效价 稀释液体积＝ 保存液浓度 ( 1920ug/ml) 抗菌药物保存液的准备3 实际操作： 先 计 算 完成一批试验需几次完成，每次 用量多少，然后可一起称量，一起稀释，然后 按每次需要量分装在试管中，贴上标签，注 明药物名称，浓度，体积数及配制日期，置 与 - 20 °C保存，备 用。 培养基 需氧菌 MH肉汤或琼脂 苛氧菌 嗜血杆菌属： Ha1emophilustest medium bas1e ＋补充因子SR158 链球菌属： MHA琼脂＋5％ 脱纤维羊血 卡他莫拉菌属： MHA琼脂＋5％脱纤维羊血 淋球菌： C C Agar Base1+ L53 厌氧菌 Wilkins chalgr1en ,anaerobe琼脂 菌液准备1 生长法： 无 茼环取4- 5个茼落大小形态一致的茼落顶部后接种于4- 5ml MH肉汤内 35°C 培 养 4- 6小时到对数生长期， 亦可过夜培养，但 不允许超过18小时 用肉汤／生理盐水校正至0蠡 5麦氏管浓度1- 2Xl 08C. FU/ ml 菌液准备、2 直接茵落悬浮法： 从孵育了18- 24h 新鲜培养物的平板上， 用无菌环取单个茵落 接种于无菌肉汤／生理盐水内 校正至0亭 5麦氏管浓度l-·2Xl 08CFU/ml 推 荐 用于苛氧菌和潜在的MRS 3菌液准备 3 对绝大多数 细菌来说，上述用生长法或直接菌落悬浮法制备的 0,. 5麦 氏 浊度的茵悬液，应该再用元菌肉 汤或生理盐水行1: 10 稀释，此 时菌液浓度为1- 2? 1 07CFU/m l ，调整 好 的茼液应该在制备后的15分钟 内完成点种 4菌液准备 4 如 一 次实验需完成50株 或100株 细菌，则细茵要编