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不同展开体系下单糖或寡糖的薄层色谱分离 近年来，随着生物材料、医学和生物化学等前沿交叉学科的发展，人们对单糖的类型尤其是单糖对遗化作用关系的认识日益提高，单糖的研究和应用已成为近年来的热点。由于糖类化合物水溶性强,极性较高,成分复杂,为其分离分析带来了困难。 虽然各种单糖和寡糖的分析已有先进的高效液相色谱法(HPLC)、高效毛细管电泳法(HPCE)、聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)和高效离子色谱法(HPIC)等,但这些方法因设备昂贵、技术性强,在实际使用过程中难免受到一定的限制。纸色谱法虽然经济,但分辨率低、重现性差,不适合寡糖分析。薄层色谱法(TLC)操作简单、耗费低且灵敏度较高,是一种简便有效的定性、半定量分析方法。 本实验以1种酸性寡糖(古罗糖醛酸寡糖)和2种中性寡糖(淀粉和右旋糖酐系列寡糖)及9种单糖为研究对象,研究了它们在不同展开体系中的TLC行为,以期为单糖组成和寡糖结构研究提供简便有效的方法。 1 半乳糖和葡萄糖醛酸对照品 淀粉,上海化学试剂公司;右旋糖酐(Dextran,相对分子质量57 000),美国Phenomenex公司;多聚古罗糖醛酸,自制;半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖醛酸(GlcA)对照品及半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Arb)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、木糖(Xyl)和鼠李糖(Rha),Sigma公司;苯胺、二苯胺、磷酸、丙酮等均为分析纯。硅胶板(G60,F254,20 cm×20 cm),Merck公司。Gel-ProTMAnalyzer图像分析软件,美国SIM生命技术国际公司。 2 方法 2.1 淀粉和右旋糖酐寡糖的制备 将多聚古罗糖醛酸按照文献方法水解,得到古罗糖醛酸系列寡糖(Oligo-GA)。将淀粉和右旋糖酐分别用0.1 mol/L HCl溶液配成5 mg/mL的溶液,封管后于100℃水解2 h,中和,在氮吹仪上用氮气吹干,分别得到淀粉寡糖(Oligo-S)和右旋糖酐寡糖(Oligo-D)。 2.2 乙胺-正丙醇-水,现收2.3520202020202030202020305. 展开剂1:甲酸-正丁醇-水(6∶4∶1);展开剂2:氨水-正丁醇-水(2.4∶60∶30);展开剂3:三乙胺-正丙醇-水(0.7∶60∶30)。显色剂:盐酸1 mL、苯胺2 mL、二苯胺2 g、85%磷酸10 mL溶于丙酮100 mL中,棕色瓶储存,备用。 2.3 显色剂的选择 硅胶板在100℃烘箱活化0.5 h,点样0.3 μL,用不同展开体系展开,放入显色剂中数秒,立即取出吹干,200℃加热1 min显色。试验重复5次,使用BIO-CAPT200E成像系统对TLC硅胶板照相,并用Gel-ProTMAnalyzer图像分析软件对数据进行分析。 3 结果和讨论 3.1 采用展开剂1下行法展开性寡糖 将2种单糖对照品(Glc、 GlcA)及3个系列寡糖(Oligo-S、Oligo-D、Oligo-GA)分别配制成5 mg/mL,点样后使用展开剂1上行法展开,TCL结果见图1和表1。由图1可见,甲酸展开体系不仅能展开酸性寡糖Oligo-GA,而且对于中性寡糖Oligo-S和Oligo-D也有很好的分离效果,并且它们的Rf值和显色也均有明显差别,如Oligo-S呈蓝色,Oligo-D呈灰蓝色,而Oligo-GA呈棕色。在酸性条件下,古罗糖醛酸容易形成内酯,极性降低,有利于分离和展开。因此,该体系十分适合于酸性寡糖的分离。 3.2 不同旋转糖酐寡糖和淀粉寡糖dp2的比较见图2 同3.1项下操作,使用展开剂2展开,TCL结果见图2和表2。 从图2可见,使用氨水展开体系对于不同连接方式的中性寡糖有较好的分离效果。右旋糖酐寡糖主要是α-1,6-连接,淀粉寡糖主要是α-1,4-连接,虽然它们dp2的Rf差别较小,但是从dp3开始,二者Rf值有明显差别,其差异性见图3。该结果对于区别α-1,6-连接寡糖和α-1,4-连接寡糖提供了有用的参考。此外,在氨水展开体系中,古罗糖醛酸以铵盐形式存在,不能形成内酯,极性增强,不易展开,因此,该体系不适合于酸性寡糖的分离。 3.3 各种单糖的展开体系 从表1可知,甲酸体系中虽然可区别Glc和GlcA,但各种中性单糖和寡糖之间的Rf值相差较小;从表2可知,氨水展开体系下Glc和GlcA的Rf值相同,表明该体系也不适合于中性单糖和酸性单糖的分离。因此,本文又在大量探索的基础上,选择了三乙胺展开体系,成功地分离了2种酸性和7种中性单糖。将GlaA、GlcA、Gal、Glc、Arb、Man、Fuc、Xyl、Rha分别配制成5 mg/mL的溶液,点样0.3 μL,使用展开剂3上行法展开,TCL结果见图4和表3。 从图4和表3结果可以看出,三乙胺展开体系对于各种单糖有良好的分离