食源性沙门氏菌对抗生素的药敏性及相关耐药基因的研究.docxVIP

食源性沙门氏菌对抗生素的药敏性及相关耐药基因的研究 非沙门氏菌是世界上最常见的导致食源性疾病的主要病原体，也是中国食源性疾病的主要病原体。我国每年约3亿人因沙门氏菌感染而患病,达病原菌食源性疾病总数的70%-80%。目前,在人类临床治疗和农业及畜牧业生产中,抗生素仍然是对付各种病原菌的首选药物。抗生素广泛使用及滥用产生的选择性压力使得很多病原菌,包括沙门氏菌均出现了多重耐药(Multi-drug Resistance,MDR)现象。监测数据表明,整个沙门氏菌属的多重耐药率已从20世纪90年代的20%增加到了本世纪初的70%。病原菌耐药性的不断增强将使现有抗生素失去相应的治疗功效,把人类推向无药可治的境地。由于耐药性可通过食物链或环境在人与食品、人与人或人畜之间传递,因此,正在快速增加的沙门氏菌耐药性不但给食品性动物生产和公共卫生安全造成了极大的危害,同时对全球食品安全和人类健康也是一个巨大的威胁。 除马国柱等(2003)和张芳等(2008)对陕西食源性沙门氏菌的污染状况进行了调查外,目前尚无该地区食源性沙门氏菌药敏性的研究报道。本研究旨在对陕西食源性沙门氏菌药敏特性及相关耐药基因进行研究,为确保食品安全提供依据。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 菌株的分离和鉴定 359沙门氏菌分离自2007—2008年采集于陕西省西安、杨凌和宝鸡等地各大超市和农贸市场的764份零售鸡肉、猪肉、牛肉和羊肉样品,菌株的分离和鉴定按照Cui等(2006)所述方法进行。沙门氏菌标准菌株Salmonella Typhimurium LT2、药敏性测定用标准质控菌株Esherichia coli ATCC25922和ATCC35218及Enterococcus faecalis ATCC29212、整合子阳性菌株Salmonella 345和Salmonella 661等均为中国药品生物制品检定所崔生辉博士惠赠。 1.1.2 养水培养基和生物技术有限责任 Luria-Bertani(LB)营养琼脂购自北京陆桥技术有限责任公司,Mueller Hinton(MH)琼脂购自北京奥博星生物技术有限责任公司。 1.1.3 药物、试剂和仪器 15种抗生素包括氨苄西林(Ampicillin)、氯霉素(Chloramphenicol)、链霉素(Streptomycin)、四环素(Tetracycline)、庆大霉素(Gentamicin)、卡那霉素(Kanamycin)、阿莫西林/克拉维酸(Amoxicillin/Clavulanic acid)、阿米卡星(Amikacin)、萘啶酮酸(Nalidixic acid)、环丙沙星(Ciprofloxacin)、甲氧苄啶/磺胺甲基异恶唑(Trimethoprim/Sulfamethoxazole)、磺胺甲基异恶唑(Sulfamethoxazole)、头孢哌酮(Cefoperazone)、头孢曲松(Ceftriaxone)和头孢西丁(Cefoxitin)等均购自Sigma公司。 1.1.4 ddertakara Ex Taq DNA聚合酶、d NTPmix、PCR产物胶回收试剂盒(Ta Ka Ra Agroase Gel DNA Purification Kit Ver 2.0)、DL2000和100 bp DNA Ladder均购自宝生物工程(大连)有限公司(Ta Ka Ra)。所用仪器及所购公司分别为:超净工作台(苏州苏洁净化设备有限公司)、生物安全柜(美国Nuaire公司)、高压灭菌锅(日本TOMY公司)、超纯水处理器(美国Millipore公司)、-40℃低温冰箱(日本SANYO公司)、-80℃低温冰箱(日本SANYO公司)、恒温摇床(上海智诚分析仪器制造有限公司)、隔水式培养箱(金坛梅香仪器有限公司)、移液器(德国Eppendorf公司)、mycycler PCR仪(美国Bio-Rad公司)、电泳(美国Bio-Rad公司)、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)、高速离心机(德国Eppendorf公司)和恒温水浴(宁波赛福实验仪器厂)。 1.1.5 引物的开发 解旋酶基因gyr A和gyr B、拓扑异构酶基因par C和par E、沙门氏菌基因岛(Salmonella Gene Island,SGI)和Ⅰ类整合子检测用引物如表1所示,使用primer Premier5软件设计,由上海捷锐生物工程有限公司合成。 1.2 最小抑菌浓度测定 采用临床实验室标准化委员会(the Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐的琼脂稀释法测定沙门氏菌的最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentrations,MICs),按照CLS