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思茅木姜子居群遗传多样性的issr分析 李品生和土壤条件植物是樟科李品生和cyliodnahm我会很好的。这是中国云南省南部亚热带雨季森林的独特树种（李杰、李锡文，2006）。思茅木姜子具有在系统演化上较为独特的假伞形花序(3–5个伞形花序生于短枝上呈总状花序),是解决和认识木姜子属系统发育极为重要的科学研究材料;同时作为热带雨林演替后期的树种,它在维持森林生态系统平衡中起着重要作用,是物种多样性的重要组成成分,具有重要的保护价值(Li et al.,2004)。 思茅木姜子主要分布于西双版纳地区低丘雨林和沟谷雨林的中层(郭晓荣等,2004),其分布区很窄。据《中国植物红皮书:稀有濒危植物》记载,其仅见于云南南部勐海、景洪和勐腊三县海拔800–1,500 m的密林中,属狭域分布植物,为濒危种(傅立国,1992)。但在本项目开展初期,在对上述三县思茅木姜子的记载分布地进行认真的野外实地考察与采样时,在勐海县却未发现有思茅木姜子分布,在其余两县也仅发现8个自然居群。在野外调查时还发现,思茅木姜子分布范围小,居群数量和个体数量均很少,自然更新缓慢;加上近年来日益强烈的人类活动干扰导致的森林片断化及生境的不断恶化,其生存已经受到了严重的威胁。而目前对思茅木姜子除在植物生态学方面有过研究报道外(郭晓荣等,2004),其他学科的研究尤其是对该物种在DNA水平上的遗传多样性等保护生物学的相关研究至今尚未见报道。 ISSR(inter-simple sequence repeat)分子标记是一种简单重复序列区间扩增多态性分子标记,具有DNA样品用量少、操作简单、快速灵敏和实验成本低等优点,而且实验重复性好、信息量大且多态性高,因而是一种非常理想的检测物种内遗传变异的分子标记,已被广泛应用于遗传多样性分析和居群生物学的研究(钱韦等,2000;杨淑达等,2005)、品种鉴定(PrevostWilkinson,1998),以及物种的分类系统学比较(HuangSun,2000;Joshi et al.,2000)等方面,同时也成为构建遗传图谱的有力工具(Kojima et al.,1998;SankarMoore,2001)。 本文采用ISSR分子标记对仅存的8个思茅木姜子自然居群的遗传多样性进行了研究,旨在阐明其遗传多样性水平和遗传结构,分析其致濒机制,从而为制定科学有效的保护策略和措施提供基础资料和科学依据。 1 材料和方法 1.1 自然居群的采样 取样尽量覆盖该物种的整个分布范围。由于该种植物分布比较狭窄,我们对仅存于景洪和勐腊县的8个自然居群均进行了取样。采样时间为2004年9月,各个居群的具体位置和采样个体数详见表1和图1。所取样品为植株的叶片,在野外迅速用硅胶干燥保存。 1.2 pcr扩增taq基因 思茅木姜子总DNA的提取采用改进后的CTAB法(DoyleDoyle,1987),每次取1.0–1.5 cm2干燥的叶片组织。 PCR反应在GeneAmp 9700 Thermocycler PCR仪上进行。25μL反应体系包括:10×Buffer(10mmol/L Tris-HCl,pH8.3;50 mmol/L KCl)2.5μL,5U/μL的Taq DNA聚合酶(TAKARA,宝生物工程(大连)有限公司)0.2μL,25 mmol/L的MgCl22.0μL10 mmol/L的dNTPs(TAKARA,宝生物工程(大连)有限公司)2.0μL,15μmol/L的引物(上海生工生物工程有限公司)1.0μL,10%的DMSO 5.0μL,50ng/μL的模板DNA 1.0μL,以及ddH2O 11.3μL。 扩增程序:94°C 5 min;94°C 50 s,退火(温度视不同引物而定)50 s,72°C 2 min,45个循环;72°C 10min。电泳条件:PCR扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳(1×TBE,100V)分离,以DNA Marker DL2000(100–2,000 bp)(TAKARA,宝生物工程(大连)有限公司)为分子标记,溴化乙锭(EB)染色显带。DNA片段通过凝胶成像系统(SYNGENE)观察记录。 1.3 数据统计分析 将ISSR琼脂糖凝胶电泳图谱记录后进行人工读带,以DNA Marker DL2000(100–2,000 bp)作为相对分子量标准,由同一引物扩增的电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性,属于同一位点的产物(杨淑达等,2005)。 按同源性条带的有无分别以1和0的格式记录并输入计算机,构成ISSR表型数据矩阵输入POPGENE 1.32软件(Yeh et al.,1997)进行分析。统计下列参数:多态位点百分率(PPB)、Shannon多样性信息指数(Ho,在物种水平上为Hsp,在居群水平上为Hpo