云南版本用issr标记分析云南椰子遗传多样性.docx

云南版本用issr标记分析云南椰子遗传多样性 0 云南柚子种质资源研究的重要性 棕榈树属于椰子科。这是典型的热带木本油料和食品能源植物。综合利弊，经济价值高，经济寿命长，享有“宝树”之称，在热作业中占有重要地位。中国种植椰子已有2000多年历史, 现主要集中分布于海南各地, 台湾南部、广东雷州半岛、云南南部和广西南部也有少量分布。云南早在三国时代就有椰子栽培, 由于受温度和降水的影响, 该地区被划为椰子不适宜区, 种植面积和产量有限。目前, 云南椰子种植面积大约为200 hm2, 年产椰果约180万个。云南椰子现主要分布于西双版纳州, 红河、玉溪、保山、临沧和德宏等地 (州) 也有零星分布。云南热区地形地貌复杂, 小气候类型丰富, 所处环境相对封闭, 椰子在长期进化过程中可能积累了丰富的变异, 研究云南椰子种质资源的遗传多样性, 可为云南椰子种质资源的进一步评价和利用提供参考, 从而促进中国椰子产业的可持续发展。 椰子种质研究是椰子育种工作的基础, 历来受到育种者的重视。早在1987—1989年间科研人员就对中国椰子集中区海南全岛开展了系统的椰子种质资源考察, 1998年又在亚洲开发银行的资助下对海南、云南和广东三省的椰子种质资源进行了调查, 并对椰子种质的变种、品种和类型做了初步鉴定和评价。目前中国已收集椰子种质174份, 对这些种质进行了入库保存, 并开展了植物学性状、农艺性状、品质性状、抗逆性状等方面的描述。随着分子生物学技术的发展, 分子标记技术广泛应用于椰子种质资源的研究。 目前使用的分子标记有RAPD、SSR、AFLP和ISSR等, 对椰子种质资源的遗传多样性、亲缘关系和QTL进行了分析, 这些研究为椰子遗传资源研究提供了大量的数据。然而, 这些研究中所使用的供试材料大多为本国或国外育成品种, 并未涉及云南椰子种质。因此, 云南椰子种质资源遗传多样性如何尚不清楚, 影响了这些种质的利用。笔者拟通过ISSR分子标记技术对在云南热区收集到的60份椰子种质进行遗传多样性分析, 为椰子遗传育种及产业发展提供参考。 1 材料和方法 1.1 材料表面 供试材料共60份, 种植于云南省热带作物科学研究所苗圃内, 椰子种质名称、来源及编号见表1。 1.2 pcr扩增及电泳 选取各供试材料幼苗的幼嫩叶片, 采用CTAB法提取样品的基因组DNA, 通过琼脂糖电泳检测其质量, 并将各样品的DNA浓度稀释到50~100 ng/μL备用。PCR反应体系是20 μL:其中10×PCR反应缓冲液 (含Mg2 +) 2 μL, 4×d NTP (2.5 mmol/L) 1.6 μL, Taq酶 (5 U/μL) 0.2 μL, DNA模板2 μL, 引物 (10 pmol/μL) 0.8 μL, dd H2O补足反应体系, 使总体积为20 μL。引物采用潘坤等筛选出的多态性较好引物中的27条, 由上海生工生物技术有限公司合成。 反应程序为:94℃预变性5 min, 94℃变性40 s, 50~ 54℃复性40 s, 72℃延伸40 s, 40个循环, 最后72℃充分延伸10 min, 4℃保存, PCR扩增在Biometric 070-951上进行。扩增产物加入2 μL 6×Loading Buffer, 用3% 琼脂糖胶电泳分离, 电泳缓冲液是0.5×TBE, 90 V/cm电压电泳40~50 min, 在Bio Spectum 300 Imaging System凝胶成像系统中观察拍照。 所得电泳照片采用人工读带, 同一位置有带纹记为1, 无带纹记为0, 建立Excel表格数据库。按照Botstein公式, 计算引物多态性信息含量。聚类分析使用软件NTSYSpc2.10e按UPGMA法进行。 2 结果与分析 2.1 引物多态性指数 采用27条多态性较好的引物分别对供试材料的基因组DNA进行扩增, 出共扩增出272条带, 其中多态性条带230条。各条引物扩增所得条带数、多态性带数、多态性百分率和引物多态性指数见表2, 其中引物UBC846扩增条带数最多 (16条) , 引物UBC828最少 (4条) ;引物UBC874扩增多态性最高 (100%) , 引物UBC868最低 (66.67%) 。平均每条引物扩增出10.07条带, 多态性带8.52条, 多态性比率84.56%。图1为引物UBC840对部分椰子种质的扩增结果, 从该图可直观地看出参试样品既有相同的扩增位点, 也有特异扩增位点, 一定程度上说明参试样品间遗传背景的同源性和多样性。特异扩增的位点可作为遗传多样性分析的依据。 2.2 云南本地椰浆酸钠的相似性系数 基于ISSR扩增结果建立的Excel数据库计算SM遗传相似系数, 这60份椰子种质的相似系数在0.305~0.983之间, 平