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不同来源沙门氏菌耐药性及其质粒耐药基因携带情况分析 沙门氏菌是一种非常重要的食源性疾病。它对人类和动物的健康有很多威胁，主要是人类发热、胃肠炎、腹泻和并发症。抗生素长时间大量使用以及诸多情况下的滥用导致沙门氏菌的耐药问题日趋严重, 同时耐药基因的广泛传播使得新的耐药菌株, 甚至超级耐药菌株不断出现, 给人类和动物的健康带来极大的危害。近20年, 沙门氏菌的多重耐药在世界各地都有报道, 各个国家沙门氏菌耐药性迅速传播, 耐药菌大量出现。监测数据表明, 沙门氏菌抗生素抗性呈现明显的上升趋势。在我国, 这种现象尤其严重, 20世纪60年代分离的沙门氏菌尚无多重耐药 (multidrug resistance, MDR) 现象, 而自上世纪70年代中期逐渐开始流行饲用抗生素, 出现大量的新型耐药菌株。据统计, 我国的耐药性增长率位居世界榜首 (在1994-2000年期间, 平均增长22%)。沙门氏菌耐药性问题已成为人们关注的焦点。 报道显示, 除基因突变外, 基因水平转移已成为导致其耐药性提高的主要因素, 即已具有抗性的可移动基因元件, 如基因盒、转座子、质粒、噬菌体和整合子等直接传递耐药基因, 从而进行耐药性的传播。质粒是宿主染色体外的可复制DNA, 携带的各种决定簇给予了宿主相应的耐药表型, 各种抗生素抗性基因大多通过质粒的接合、转化和转导等方式获得, 这就使细菌新耐药性的出现更频繁且耐药性更强。本文拟研究食源性和医源性沙门氏菌由质粒编码的耐药表型及质粒耐药基因型, 旨在为食品安全风险评估提供理论依据, 同时为临床治疗用药选择提供借鉴。 1 材料和方法 1.1 菌株、质控菌株及仪器 本研究采用的沙门氏菌分离株共226株, 其中148株为食源性菌株, 分离于猪肉、鸡肉、蔬菜等食品, 为本实验室保藏;78株为医源性菌株, 由上海市疾病预防控制中心提供。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。 引物, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;PCR反应所用试剂, 加拿大Fermentas生物工程公司。 哥伦比亚血平板, 广州环凯微生物科技有限公司;AST-GN13细菌药敏测试卡片、VITEK-2Compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪, 法国Bio Merieux公司;Nanodrop ND-1000微量核酸蛋白测定仪, 美国Nano Drop公司;Mastercycler pro PCR仪, 德国Eppendorf公司。 1.2 方法 1.2.1 细菌培养与药敏测试 用哥伦比亚血平板过夜培养, 挑取1~2个菌落, 利用全自动细菌鉴定及药敏分析仪进行细菌鉴定和药敏试验, 测定MIC值, 并严格按照CLSI标准判断药敏结果, 质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。 接种新鲜的沙门氏菌在哥伦比亚血平板上培养18~24 h, 取2只试管 (编号分别为1, 2) 分别加入3 m L 0.45%无菌盐水, 用无菌棉签挑取血平板上1~2个菌落, 在试管1中打散混匀, 调至0.5~0.7个麦氏浓度。从试管1中吸取145μL至试管2中, 混匀。将细菌药敏测试卡片导入管插入试管2中, 放入填充仓, 待菌液被压入卡片中。待指示灯闪烁后取出, 放入切割仓, 指示灯闪烁后, 取出试管架灭菌处理, 在操作系统中输入菌株编号进行测定。 1.2.2 质粒质量浓度测定 用碱裂解法提取沙门氏菌质粒DNA, 使用微量核酸蛋白测定仪测定质粒质量浓度, 然后用无菌去离子水调整其终质量浓度为25 ng/μL, 20℃保存, 备用。 1.2.3 耐药基因携带情况和耐药菌株间质粒耐药基因比较 沙门氏菌中常见的质粒耐药基因包括β-内酰胺类抗生素耐药基因TEM、OXA、CMY和PSE等, 喹诺酮类抗生素耐药基因qnr A、qnr B、qnr S、qnr C和qnr D等, 以及氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素耐药基因acc (6’) -Ib-cr等。本研究中, 所有耐药菌株均用β-内酰胺类耐药基因进行检测, 耐环丙沙星和左氧氟沙星抗生素的菌株检测其qnr基因的携带情况, 耐环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星抗生素的菌株用acc (6’) -Ib-cr基因特异性引物进行检测。抗生素耐药性试验中表型属于中介 (I) 的分离株, 其质粒耐药基因携带情况也加以检测。不同来源分离株中质粒耐药基因携带率的比较用SPSS 16.0软件进行统计分析。引物序列见表1。 PCR反应条件:95℃4 min;94℃1 min, 一定退火温度 (TEM、OXA、CMY、qnr C、qnr D分别为57, 51, 60, 59, 59℃;PSE、qnr A、qnr B、qnr S和aac (6’) -Ib-cr均为61℃) 30 s, 72℃30 s, 35个循环;72℃10 min。 2 结果