锌胁迫对水车前叶细胞超微结构的影响.docxVIP

锌胁迫对水车前叶细胞超微结构的影响 在水污染方面，重金属污染最为突出，主要来源是入境材料、泄漏和大气沉降（walter，1997）。由于重金属污染物不但不能被微生物所分解,而且能在生物体内富集,并通过水生食物链的生物放大作用而对高营养级的生物甚至人类造成危害,因此日益引起人们的特别关注。而Zn作为兼具营养与毒性的元素(王夔,1992),国内外文献缺乏其对水生植物影响的报道。 自从60年代末,Fridouich等提出生物自由基伤害学说以来,已被广泛的应用于需氧生物细胞毒害机理的研究。SOD(超氧化物歧化酶)、CAT(过氧化氢酶)、POD(过氧化物酶)作为植物体内抗氧化酶系统的重要组成部分,在清除自由基方面发挥重要作用。前人的研究指出重金属胁迫能使植物叶中自由基积累(罗立新等,1998),从而诱导自由基过氧化损伤(黄玉山等,1997),然而并没有与超微结构的变化相联系。本文以沉水植物水车前为实验材料,系统的研究了在重金属Zn胁迫下,其叶细胞内自由基的积累及超微结构的变化,并对二者之间存在的关系作初步探讨。旨在揭示重金属胁迫对植物膜系统伤害的作用机理。 1 材料和方法 1.1 生长状态的选择 水车前[Ottelia alismoides(L.)Pers]采自江苏省胜浦镇。 采回材料后,在实验室的玻璃缸(20L)中用蒸馏水驯化培养一周后,选取生长状态一致的植株,移入含有ZnSO4.7H2O的培养液中,浓度梯度为1 mg/L,5 mg/L,50 mg/L,100 mg/L,200 mg/L(以纯锌计),另设对照为0。 1.2 方法 1.2.1 活性和可溶性蛋白测定 取新鲜叶片,蒸馏水洗净,揩干,电子天平称重。放入加了少量50mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.8)的研钵中冰浴研磨,10000×g下离心20min,上清液用作SOD、POD、CAT活性、MDA(丙二醛)和可溶性蛋白含量分析。 1.2.2 测定了蓝色信号的含量 分光光度法(华东师范大学生物系植物生理教研组,1980) 1.2.3 叶片的sod活性的测量 化学比色法,按从南京建成生物工程研究所购买的试剂盒的顺序测定 1.2.4 叶片表面活性剂的测定 愈创木酚法(华东师范大学生物系植物生理教研组,1980) 1.2.5 叶片自治活动的测定 一般分光光度法,按从南京建成生物工程研究所购买的试剂盒的顺序测定 1.2.6 sda含量的测量 按林植芳等(1984)的方法 1.2.7 可溶性固形物含量的测定 考马斯亮蓝染色法(李建武等,1994),以结晶牛血清清蛋白为标准,测595nm处的光吸收 1.2.8 双氧铀—叶肉细胞超微结构的电镜观察 Zn处理第6天上午,取拳卷幼叶,用2.5%戊二醛和2%锇酸双重固定,丙酮系列脱水,Epon812包埋,LKB超薄切片机切片,切片经醋酸双氧铀—柠檬酸铅双重染色后,于Hitachi_A_2型投射电镜下观察并拍照。 2 结果 2.1 zn对叶绿素含量的影响 从图1看出,Zn处理后,仅在1 mg/L处理浓度下的含量与对照相当,而随着处理浓度的增大呈下降趋势,200 mg/L的Zn处理使叶绿素含量降为对照的6.97%,说明高浓度的Zn对叶绿素破坏极显著。 2.2 zn对叶片sod活性的影响 随处理浓度的增加,SOD活性下降,其中200mg/L处理的酶活性比对照减少了64.79%(图2)。 2.3 dmg/l对k-l活性的影响 由图3可知,POD活性在5mg/L浓度下有一抗性峰出现,大于此浓度则引起活性的下降,100mg/L处理的酶活性略小于对照的活性。而200mg/L则严重破坏了该酶的活性,使活性比对照减少了近一半。 2.4 zn对叶片mct活性的影响 CAT活性从1～100 mg/L处理呈上升趋势,200mg/L处理使酶活性下降,但仍高于对照83%(图4)。 2.5 zn对可溶性蛋白质含量的影响 可溶性蛋白含量受Zn的影响比较明显,随处理浓度的增大几乎呈直线下降趋势,特别是200mg/L处理使含量仅为对照的6.29%(图5)。 2.6 膜脂过氧化程度 MDA作为膜脂过氧化的产物,其含量的多少可用来反应膜脂过氧化程度的强弱。Zn处理使MDA含量随处理浓度的增大而上升,200mg/L处理的含量是对照的3.6倍,表明高浓度的Zn加剧了对膜的破坏(图6)。 2.7 叶细胞毒性试验 叶绿体是绿色植物所特有的细胞器。在正常叶细胞中叶绿体通常为椭圆形,类囊体基粒和片层排列整齐(图版1,1)。Zn处理后,叶绿体以两种不同的方式遭到破坏:一种是叶绿体膨胀成圆形,部分膜破裂(图版1,2),随毒害的加重,类囊体基粒和片层膨胀更明显,外膜消失(图版1,3),肿胀的类囊体散开(图版1,4)直至散布在细胞质中(图版1,5);第二种方式是叶绿体膨胀,类囊体排列紊乱甚至相互垂直,而叶绿体