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hiv-1a介导脂质体作为药物载体在脊髓损伤大鼠体内分布的靶向性研究 严重的髓质伤（rc）可导致不可逆转的运动和感觉障碍。随着技术的发展,更多新的治疗脊髓损伤的大分子药物及具有治疗作用的基因应运而生,但由于血脊髓屏障的存在,使得这些大分子物质无法进入损伤的脊髓内部起到治疗作用。纳米高分子材料载体,具有靶向运载药物的作用,以往研究证实其能够介导大分子物质穿越血脑屏障。本研究探讨由HIV-1反式转录激活因子(trans-activator transcription,TAT)介导的脂质体对血脊髓屏障的穿透能力及其对受损脊髓组织神经元的靶向性作用。 1 材料和方法 1.1 表面活性剂和仪器 健康雌性Wistar成年大鼠60只,8周龄,体重220±10g,中国医学科学院放射医学研究所提供。异双功能H2N-PEG-COOH(PEG:Mn 5000)(Nektar,USA);TAT(吉尔生化有限公司);壳聚糖(脱乙酰化99%,Mn 5×104)(青岛海普生物技术有限公司);Impactor ModelⅡ打击器,超净工作台(天津医药设备厂);CO2培养箱(NAPCO 5410,USA);荧光倒置显微镜(OLYMPUS BX-60,Japan);恒温冰冻切片机(LEUCER,USA)。 1.2 阳离子高聚物脂质体的表征 采用反相蒸发法制备脂质体。用羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐(octadecyl quaternized carboxymethyl chitosans,OQCMCs)及胆固醇形成稳定的双层膜结构,制备出阳离子高聚物脂质体。脂质体表面连接聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)作为脂质体的膜稳定剂。分别构建外接HIV-1 TAT和不连接TAT的两种脂质体颗粒。构建完成后使用透射电子显微镜观察脂质体形状,激光粒度仪和Zeta电位仪测定脂质体粒径和Zeta电势。脂质体均外接异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)进行示踪。其中FITC、TAT、PEG均通过N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)相连接。 1.3 肌肉损伤、腰椎滑血工酶及术后体验 60只大鼠随机分为2组,每组30只,每组分为未损伤、伤后24h及伤后1周共3个时间点,每个时间点10只。每组20只大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35ml/100g)后,取俯卧位,固定在手术台上,常规备皮、消毒,以T10为中心纵行切开背部皮肤及皮下组织,剥离两侧椎旁肌,暴露并咬除T10棘突及椎板,显露硬膜。应用Impactor ModelⅡ脊髓打击器10g重量从25mm高度自由落体打击,大鼠立即出现一过性鼠尾摆动和后肢痉挛。操作中均未出现硬脊膜破裂。逐层缝合肌肉、筋膜和皮肤,术后1周内肌注青霉素(每日两次,每次20万单位)。Ⅰ组大鼠每个时间点尾静脉注射外接TAT的脂质体,Ⅱ组大鼠每个时间点尾静脉注射不接TAT的脂质体,脂质体定量为实验安全剂量,终浓度为9μg/ml,每只注射500μl。 1.4 支护和石蜡切片 注射完脂质体之后的大鼠平静放置1h,用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉,剪开胸腔,暴露心脏,经左心室插入导管至升主动脉,剪开右心房;先快速灌注生理盐水约200ml,再灌注4℃4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液500ml,其中前1/3量快速灌注,后2/3量慢灌注。随即取T7~L1脊髓节段,于后固定液(4℃4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液)中固定12h,0.1M pH值7.4的PBS彻底冲洗,逐级脱水,石蜡包埋,垂直脊髓纵轴连续5μm石蜡切片。每组每个时间点每只大鼠随机抽取损伤中心5张切片,另外外接TAT组伤后24h在损伤中心远端与近端再各随机抽取5张切片,使用荧光倒置显微镜,激发光波长490~520nm,直接观察连接FITC的脂质体暗视野下在组织中的聚集情况。应用Image pro plus 6.0软件进行图像分析,分析对象为镜下FITC荧光的平均光密度(average optical density,AOD),每张切片随机抽取灰质内3个不连续视野进行测量,结果取所得AOD的平均值。 1.5 aod比的计算 用SPSS 16.0软件包进行统计学分析。数据以均数±标准差表示,同一时间组间AOD值比较采用两组独立样本资料的t检验,P0.05为有统计学差异。 2 结果 2.1 zeta电势 制备的脂质体用激光粒度仪测定其粒径约为15.5nm,Zeta电势高达38.22mV。透射电镜观察,脂质体粒径大约为15nm,与粒径仪所测结果类似,粒子呈球形,分布比较均匀,分散性较好,几乎没有发生团聚现象(图1)。 2.2 髓内taod和外接tat脂质体的荧光分布 外接TAT组在倒置荧光显微镜下观察,未损伤、伤后24h及伤后1周脊髓内部均可见FITC