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番茄青枯病抗性基因ssr标记的筛选 番茄青干病是我国长江以南、特别是我国南方番茄生产的严重疾病。这种疾病是一种土壤传播疾病，有广泛的捐赠者风格和严重的疾病，给预防和治疗带来了困难。抗病繁殖是预防和预防疾病的最有效方法。 一般认为,番茄对青枯病的抗性育种由隐性基因控制,因而年限较长;此外,环境因素及鉴定方法也影响植株的抗性表现,利用分子标记技术对青枯病抗性进行辅助选择能弥补这两方面的不足。SSR标记是众多分子标记技术中一种较好的方法,它具有共显性、操作简便、重复性好等优点,但发展SSR标记成本较大,需要特定物种的已知序列。为快速筛选得到番茄青枯病抗性基因的SSR标记,笔者利用前期工作发展的SSR标记对不同抗性的番茄材料进行了分析。 1 材料和方法 1.1 材料表面 供试番茄材料来自4个国家共27份(表1);病原菌为从华南农业大学园艺学院蔬菜试验场番茄病株上分离并纯化的毒性菌株。 1.2 育苗材料 于2006年4月5日播种进行营养杯育苗,每份材料20株。苗龄35 d时用该实验室的方法进行伤根接种,接种后15 d时进行植株调查并计算发病率。 1.3 pcr扩增dntp 根据文献报道的标记序列合成了166对SSR引物,这些标记部分已被定位。按Hemming等的方法提取番茄叶片的基因组DNA。20 μl PCR反应体系中包括0.15 μmol/L的引物、200 μmol/L dNTP、1×PCR反应缓冲液(50 mmol/L KCl、10 mmol/L Tris-HCl pH 8.3、1.5 mmol/L MgCl2、0.01%明胶),50~100 ng的DNA模板、1 U Taq酶。反应在PE9700型热循环仪中进行。所用的反应程序为:94 ℃预变性5 min,循环(94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min)35次,最后72 ℃延伸5 min。 PCR产物用6%聚丙烯酰胺变性凝胶电泳,250 V条件下稳压电泳约3 h;普通银染显带,数码相机照相。 2 结果与分析 2.1 结果表1 番茄接种病原菌后7 d开始发病,21 d时统计发病率,结果见表1。由表1可知,国外来的材料大多数都不抗病,只有从国内收集的3份材料表现出理想的抗病性,其中“湘引79-1”表现为高抗,“860”及“039-3”表现为抗病。 2.2 标记多态性分析 利用166个标记对27份材料进行分析,134个标记的扩增产物主带明显,其他标记没有扩增产物或扩增出多条弱带,134个标记中65个标记在27份材料上能检测出多态性,来自基因组序列的SSR标记多态性指数高,而来自EST序列的标记多态性低,很多标记没有多态。 65个标记中,标记TOM176-177在“湘引79-1”、“860”及“039-3”3份抗病材料上能扩增出相同带型,而在其他材料上扩增出的带型不同。TOM176-177根据基因组序列发展而来,其多态性较好,在27份材料上存在4个等位基因,在3份抗病材料上是同一个等位基因,其扩增产物比其他等位基因小(图1)。 3 抗和感材料标记 一般认为,应从病害发生严重的地区收集抗病资源,该文研究结果支持了这一观点。该研究中鉴定为抗病的材料都来自中国,而我国长江以南特别是华南地区是番茄青枯病发生比较严重的地区;而在美国、澳大利亚及英国青枯病不是番茄的主要病害,因而来源于这些国家的材料大多不抗病。 该研究通过对一组抗、感材料进行SSR标记分析,找到一个多态性好的标记TOM176-177,并检测出在3份抗病材料中存在特异的等位基因,初步说明该标记与抗病基因连锁,且很有可能这些材料中含有的抗病基因来源相同。标记TOM176-177位于番茄染色体12中部着丝粒附近,而有研究表明,该区段存在一个对台湾青枯菌株系具特异抗性的主效QTL,这从另一方面为TOM176-177与青枯病抗病基因连锁的结论提供了证据。 通过对抗、感材料构建的F2群体分析,可进一步验证TOM176-177是否与青枯病抗病基因连锁,并计算出连锁距离,这方面的工作正在进行中。