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淹水条件下小麦根通气组织形成的细胞学和活性氧的变化 湿害是长江中下游小麦生产中常见的自然灾害。这是小麦产量、稳定性和品质的主要限制因素之一。在湿害发生时, 由于O2在水中扩散的速度远小于在空气中扩散的速度, 根系会严重缺氧。淹水条件下, 很多植物根中能产生通气组织, 这有利于O2通过内部低阻力的气体通道扩散到根部, 从而促进根部的能量供应和营养吸收, 同时随着O2从根系向根际扩散, 根际环境也得到了改善。小麦根在淹水条件下也能形成通气组织, 缓解湿害造成的危害。淹水条件下, 很多植物 (如玉米、水稻) 通过根皮层细胞发生细胞程序化死亡 (Programmed cell death, PCD) 形成通气组织, 而乙烯被认为是根皮层细胞PCD启动的第一信号。淹水还会使植株抗氧化酶活性迅速下降, 造成植物组织中的活性氧 (Reactive oxygen species, ROS) 积累, ROS的积累能诱导PCD的发生。Muehlenbock等在研究拟南芥淹水时发现, 乙烯和ROS都参与诱导了通气组织的形成, 而且ROS信号出现在乙烯信号之前。 目前, 关于小麦抗湿生理方面的报道较多, 但对于根通气组织形成过程中的细胞学特征报道较少, 特别是从分子生物学和细胞生物学方面研究小麦根通气组织形成的PCD特征, 以及该过程与ROS关系方面的报道更少。本研究以高度耐湿的华麦8号幼苗为材料进行淹水处理, 在显微结构水平上系统地观察了次生根通气组织的形成过程;通过分子生物学方法检测核DNA的断裂;通过特异性荧光染色检测根中的ROS变化, 以期揭示小麦通气组织形成的细胞学特点。 1 材料和方法 1.1 不同光照、光照和光照强度对不同生长阶段患者dna的不同处理 实验材料为小麦品种华麦8号, 该品种耐湿性很强。种子消毒、发芽后转入装有蛭石 (已灭菌) 的塑料盆 (直径9 cm, 高8 cm) 中培养, 每天浇1/2的Hoagland营养液以保持60%湿度 (此时蛭石孔隙率约50%, 通气性良好) 。培养室 (已消毒) 条件:20℃, 70%相对湿度, 光照14 h/d、光照强度100～200 μmol photons·m-2·s-1。 在发芽30 d (大约4.5叶) 时进行淹水处理。淹水处理时间分13个梯度:0.75 h、1.5 h、3 h、6 h、9 h、12 h、18 h、24 h (1 d) 、48 h (2 d) 、96 h (4 d) 、192 h (8 d) 、16 d和60 d进行淹水, 水面高出蛭石表面0.5～1 cm。分别设置0 h、1d、2d、4 d、8 d、16 d不淹水的处理为对照。 以新生次生根为实验材料 (根长≥8 cm) , 取距根顶端6 cm的次生根节段进行冰冻切片、石蜡切片。取距根尖4～8 cm的次生根节段抽提DNA。淹水60 d的处理, 以生长于根系中部的次生根为材料, 取距根顶端70 cm的次生根节段进行冰冻切片。 对淹水1 d、2 d、4 d、8 d、16 d及相应对照进行次生根统计 (植株数n=15) 。 1.2 ros荧光检测 取淹水处理和对照的根节段, 用Tissue-Tek OCT 4583 compound (Sakura Finetek USA) 包埋, 在冰冻切片机 (Leica CM1850, Germany) 上进行切片 (横切) , 切片厚度20 μm。冰冻切片未经染色放在蒸馏水中, 用荧光显微镜 (Nikon Eclipse 80i) 观察显微结构和自发荧光, 激发光和散射光波长分别为450～490 nm (蓝) 和526 nm (绿) 。ROS荧光检测用H2DCF-DA (Sigma) , 参照Bouranis等的方法。冰冻切片在5 μM H2DCF-DA (蒸馏水配制) 中染色1 h (25℃) , 蒸馏水水洗, 然后进行荧光观察, 激发光和散射光波长分别是450～490 nm (蓝) 和520 nm (绿) 。 1.3 tunel检测 取淹水处理和对照的根节段, 迅速用FAA固定3 h以上, 乙醇梯度脱水 (50%、70%、85%、95%、2×100%, 每次20 min) , 二甲苯梯度透明 (50%, 75%, 2×100%, 每次2 h) , 梯度浸蜡 (50%, 75%, 每次3 h, 纯蜡过夜) 然后包埋。用石蜡切片机 (Leica RM 2235 Germany) 切片, 厚度10 μm, 将切片粘片到poly-L-lysine包被的玻片上。从8条根中随机选取切片, 在玻片上排成5行, 每行大约7片, 进行TUNEL反应和阴性对照。TUNEL检测采用细胞凋亡荧光检测试剂盒 (Promega G3250, USA) , 实验操作完全按照试剂盒的说明书进行。为了降低非凋