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16srrna在微生物检测中的应用 长期以来，传统的分类方法主要采用分离、形态特征、生化反应和免疫学，但这些方法都存在着长期存在的问题，尤其是缺乏特异性和敏感性，这难以满足现代细胞学研究的发展要求。随着分子生物学技术的迅速发展,特别是聚合酶链式反应(PCR)技术的出现及核酸研究技术的不断完善,产生了许多新的分类方法,如质粒图谱、限制性片段长度多态性分析、PCR指纹图、rRNA基因(即rDNA)指纹图、16S核糖体核糖核酸(ribosomal RNA,rRNA)序列分析等。这些技术主要是对细菌染色体或染色体外的DNA片段进行分析,从遗传进化的角度和分子水平进行细菌分类鉴定,从而使细菌分类更科学、更精确。特别是16S rRNA基因序列分析技术的出现,使细菌进化与否可以通过试验研究来证实,这是细菌分类史上的一次革命。目前,关于PCR扩增16S rRNA基因用于细菌分类和鉴定的研究越来越多,大多数致病菌的16S rRNA基因均已被测序。本文就该基因的特征、研究方法、检测方法、临床应用与研究进展等作一简要综述,以供相关研究人员参考。 116 srrna基因缺失 16S rRNA为原核生物的一种核糖体RNA。目前,细菌系统分类学研究中最有用和最常用的分子钟是rRNA,其种类少,含量大(约占细菌RNA总量的80%),分子大小适中,在漫长的生物进化过程中,其基因序列的变化非常缓慢,可以用来标记生物的进化距离和亲缘关系,具有良好的时钟性质; 在结构与功能上具有高度的保守性,素有“细菌化石”之称。 细菌中编码rRNA基因按5′.16S.23S.5S.3′方式排列的,由2个非编码的间隔区序列(Internal Transcribed Spacers,ITS)分开,5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA 3部分组成一个RNA操纵子,作为一个单位转录,再加工成为成熟rRNA。16S rRNA是所有原核生物蛋白质合成必需的1种核糖体RNA,其具有以下特点:(1)多拷贝。每个细菌含5~10个16S rRNA拷贝,这使得检测敏感性较高。(2)多信息。16S rRNA基因内部结构由可变区和保守区组成。保守区为所有细菌所共有,可变区在不同细菌之间存在不同程度的差异,具有属或种的特异性,可变区与保守区交错排列。因此,可根据保守区设计各种细菌的通用引物,也可根据可变区设计特定细菌的特异引物或探针。16S rRNA基因可变区所含信息的种间差异,使检测具有特异性。(3)长度适中。16S rRNA编码基因长度约1 500 bp,包含大约50个功能域。 216 pcr和ssrrna基因序列分析 16S rRNA基因序列分析技术就是从微生物样本中提取16S rRNA的基因片段,通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得16S rRNA基因序列信息,再与16S rRNA数据库中的序列或其他数据进行比较,确定其在进化树中位置,从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。 16S rRNA基因序列既能体现不同菌属之间的差异,又能利用PCR技术较容易地得到其序列。所以,通过对其序列的分析及同源性比较, 可以计算、了解不同菌属和菌种在遗传进化方面的距离,判定不同菌属、菌种间遗传关系的远近,绘出进化树,从而达到对细菌进行分类的目的。目前,人类许多疾病的致病因子均是通过PCR扩增16S rRNA基因,然后进行序列分析而被发现的。所有种类细菌中至少有1个16S rRNA基因拷贝,而且不受观察者主观意识影响,因此如果不同细菌中有2个16S rRNA基因序列不同即可以认为他们属于不同菌种。可以认定,16S rRNA基因序列分析技术在鉴别异常细菌引起的疾病上具有重要意义。 采用系统发育分析方法,如距离矩阵法(Distance Matrix Methods)、聚类分析法(Cluster Nalysis)以及一系列的简约法等,对6S rRNA基因测序结果进行分析,通过计算可知该样本在进化树中的位置。常用的序列比对软件有MicroSeq、PAuP、BLAST和Phylip。值得注意的是,这些软件使用的计算方法不同,因此结果可能有一定的差异。 ,这些共享资源极大地推动了细菌鉴定工作的进展。 316 表型鉴定与16srrna基因序列分析 与传统的以细菌形态和生理、生化特性为依据的表型特征分类方法相比,16S rRNA基因序列测定在分析、鉴定细菌进化过程及亲缘性方面具有突出特点,其最大的优势是检测速度快,这是常规的细菌鉴定和培养方法无法比拟的。另外,一部分用表型方法鉴定有困难的细菌,用16S r RNA基因序列分析能进行准确地鉴定。目前,已对2 000种(约占真细菌总数的50%)以上真细菌的16S rRNA基因进行了测序,不同菌属的16S rRNA基因序列同源性为70%~95%。 3.1 srrna基因测序结果