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动态浊度试管仪在血红蛋白细菌内毒素检测中的应用 细菌内毒素是革命兰氏阴性菌细胞中的脂肪醇和微针蛋白的化合物。它的特点不是细菌和细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后释放的内毒素生物活性物质。加强对药品和人体液中的细菌内毒素监测,对确保人体健康具有十分重要的意义。自1964年美国人Frederic B·Bang和Jack Levin发现细菌内毒素可以使一种海洋生物鲎的血细胞溶解物迅速发生凝集反应以来,产生了灵敏的细菌内毒素检查法,至今美国药典规定已有近800种药物要用细菌内毒素检查法来做为质量控制手段。我国由于2005年版药典收载的细菌内毒素检查法出自国际上的统一调和案,所以它是我国现在最和国际接轨的一部检查法,按照2005年版药典的方法来进行检查是可行和先进的。动态浊度法是光度法定量测定内毒素含量的一种,其原理为利用鲎试剂与内毒素的混合物在反应过程的透光度变化与内毒素浓度的关系来定量检测内毒素。目前国内血站系统运用这种方法的报道尚不多见。笔者运用32孔动态浊度试管仪对一次性注射器、血袋保养液、洗涤红细胞用生理盐水、机采耗材、病毒灭活滤白血浆耗材等原辅材料进行抽样检测,现将结果报道如下。 1 材料和方法 1.1 细菌内毒素测定 一次性注射器,机采耗材,病毒灭活滤白血浆耗材内无液体,在生物安全柜内灌注注射用生理盐水,置37℃培养箱内培养24 h后,取样进行细菌内毒素测定。血袋保养液取样后用无热原水做1∶90稀释后进行细菌内毒素测定。洗涤红细胞用生理盐水直接取样后进行内毒素测定。 1.2 细菌内毒素测定 鲎试剂批号为0609272,灵敏度为0.03125 EU/ml;细菌内毒素工作标准品批号为0605090;细菌内毒素检查用水批号为0701110。阳性对照取0.03125 EU/ml。以上试剂均由湛江安度斯生物有限公司提供,所有批号的试剂均在有效期内使用。仪器为英国Lab Kinetics有限公司生产的32孔ATi动态浊度试管仪,配以湛江安度斯生物有限公司开发的BET专用软件,实验反应温度为37℃,浊度测定波长为405nm。 1.3 采样方法 所有批号采血原辅材料随机抽样进行检测。 1.4 标准内毒素的检测 检测依照试剂操作说明书进行。实验前,先预热动态试管仪,使其达到反应温度。将标准内毒素制备成至少3个浓度的稀释液,相邻浓度间稀释倍数不得大于10,最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。标准曲线的最低检测限(0.03125 EU/ml)为每次标本检测实验的阳性对照。 1.5 细菌毒素检测 将细菌内毒素工作标准品稀释成2.0、0.25、0.03125EU/ml等3个不同浓度,每个浓度做3个平行孔,并使用经过250℃120 min干烤无热原的试管及毛细管为一次性耗材。细菌内毒素检查用水作为阴性对照,做2个平行孔。实验结果满足下列条件判为有效:阴性对照管的反应时间大于标准曲线最低浓度(0.03125EU/ml)的反应时间;标准曲线的相关系数|r|≥0.980;变异系数CV%10%。当|r|=1时,其标准曲线的线性最好。 2 结果 2.1 阴性对照的标准曲线 标准曲线的具体结果见表1。从表中可以看出,阴性对照符合要求,标准测得值的相关系数为0.9957,符合相关系数必须大于0.98的要求,故此标准曲线有效。 2.2 内毒素的测定 从表1可以看出内毒素的实际测定值,参考表1的标准曲线,一次性注射器的内毒素实测值小于0.0327 EU/ml,机采耗材的内毒素实测值小于0.0244 EU/ml,病毒灭活滤白血浆袋,生理盐水,血袋保养液的内毒素实测值分别小于0.0153 EU/ml,0.0178 EU/ml,1.7724 EU/ml,结果都小于药典规定值。原辅材料的检测结果见表2。 3 根据本实验的总要求进行检测 从表1可以看出,标准曲线阴性对照的反应时间(1 660 s)大于标准曲线最低浓度的反应时间(1 396 s);标准曲线的相关系数的绝对值为0.9957,大于0.98;变异系数CV%为4.322、1.3、0.535,均小于10%。说明标准曲线是可靠的,本实验室的条件满足细菌内毒素测定(bacterial endotoxin test,BET)的要求,实验人员的实验技能满足BET实验的要求,实验所用试剂(包括鲎试剂、内毒素标准品、BET水等)满足BET实验要求,因而进行的BET测定结果是可靠的。同时说明运用动态浊度试管仪在血站系统对原辅材料进行BET测定具有灵敏度高、线性关系好、实验稳定等优点,对仪器的维护校准要求较低。 从表2可以看出,每种原辅材料的阴性对照的反应时间均大于阳性对照(最低浓度)的反应时间,内毒素实测值也都符合要求。有见血站对一次性采血袋(血袋保养液)和一次性注射器进行细菌内毒素检测,未见对成分制备相关原辅材料内毒素的检测报