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影响大肠杆菌壳聚糖抗菌活性的因素 壳聚糖是通过脱乙酰基从甲壳素中分离出来的。由于其资源丰富、无痛、无菌、良好的生物相容性和生物可分解性，研究和开发非常迅速。1979年，allan等人提出了壳聚糖的抗性。根据贝壳糖在细胞中的作用位置不同，学术界推测了外壳糖的抗菌机制：一个是年轻科学家提出的具有负电荷腔反应的机制。另一种是hadwigar提出的一种用于细菌分子中dna作用的抗菌机制。到目前为止，还没有关于地壳糖抗菌机制的最终结论。本文在系统研究了地壳聚糖纤维的应用，并使用了辐射共焦显微镜对地壳聚糖各结合物的影响。为未来的织物抗菌和地壳聚糖扩展的应用提供了理论依据和数据。 1 实验部分 1.1 电子显微镜和壳聚糖 756-MC型紫外分光光度计,上海市光学仪器厂生产;HITACHI-X510型扫描电子显微镜,日本日立公司生产;TCS NT激光共焦显微镜,美国Leica公司生产. 壳聚糖由青岛药物研究所提供;大肠杆菌菌种由南开大学生命科学学院提供;生化试剂牛肉膏、蛋白胨、琼脂,天津市东方卫生材料厂生产;盐酸、醋酸、氢氧化钠、氯化钠均为化学纯. 1.2 初始菌液的制备 培养基:牛肉膏5 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,用去离子水定容至1000 mL,用1 mol/L NaOH或HCl调节pH至7.0~7.2,高压蒸气灭菌. 用接种环取一环低温贮藏的斜面大肠杆菌(Escherichia coli)菌种,转接到250 mL液体培养基中,置摇床(37 ℃,150 r/min)振荡培养24 h,用无菌刻度吸管吸取1 mL此菌液,在以上条件下重复培养24 h,将此菌悬液用无菌蒸馏水配制成细胞浓度为105~106个/mL数量级的初始菌液. 1.3 强化转导剂-级配对聚糖的制备,制备法上的fige-转糖溶剂剂. 将纯粘胶纤维和含有壳聚糖的粘胶纤维分别与菌液在液体培养基中放置24 h后漂洗,在临界点干燥器内干燥,置于扫描电镜下观察. 将壳聚糖溶于20 mLV(水)∶V(乙醇)=1∶1的混合溶剂中,加入FITC溶液,冰点下搅拌反应24 h;将FITC-壳聚糖齐聚物离心沉淀,用乙醇漂洗,晾干. 得FITC标记物. 将FITC-壳聚糖溶于培养基中,调节pH至7.0左右,加大肠杆菌培养液,在摇床上振荡培养24 h后,培养到FITC-壳聚糖齐聚物上的大肠杆菌,用离心机收集,生理盐水漂洗;聚集的有机体用超声波在生理盐水中破碎分散后滴在无荧光玻片上空气干燥(盖玻片经含叠氮化钠的50%(质量分数)甘油水溶液处理后再用). 最后用激光共焦显微镜观察荧光现象. 以上操作均在避光条件下进行. 1.4 培养基的抗菌活性测定 将一定量的壳聚糖样品,溶解于质量分数为1%的HAc溶液中,配制成浓度为1%的壳聚糖-醋酸溶液. 将培养基分装在试管中(10 mL/管),并加入0.2 mL菌液和一定量壳聚糖-醋酸溶液,将试管置于37 ℃水浴中以150 r/min振荡. 定时取样,以1%的HAc溶液为空白样作参比,用紫外分光光度计测定细菌培养液的浊度(O.D.),并以此表征壳聚糖的抗菌活性. 2 结果与讨论 2.1 壳聚糖对大肠杆菌细胞的作用 图1为纤维表面吸附大肠杆菌的扫描电镜照片. 可以看出,不含壳聚糖的粘胶纤维表面只吸附了少量大肠杆菌细胞,且细胞形态未发生变化;含壳聚糖的纤维表面吸附了大量的杆菌细胞,细胞的轮廓逐渐模糊且发生了不同程度的凹陷变形. 说明壳聚糖对大肠杆菌有较强的吸附能力,并可使其细胞变形,乃致溶解. 图2为与壳聚糖齐聚物作用的大肠杆菌细胞的激光共焦显微镜照片,图中荧光部分为被FITC标记的壳聚糖齐聚物,荧光所围成的轮廓为大肠杆菌,图2(a)自上而下,由左向右依次为含有壳聚糖齐聚物(Mw=8000)的大肠杆菌细胞由表及里的剖面图,图2(b)是其最中间的剖面,由图2(a)和(b)可见,由菌体表面到内部,荧光逐渐增强,说明壳聚糖齐聚物(Mw=8000)进入到了杆菌细胞内部. 2.2 壳聚糖的抗菌性及其与大肠杆菌培养液浊度的关系 图3为壳聚糖浓度(质量分数)与大肠杆菌培养液浊度的关系图. 如图所示,随着壳聚糖浓度的增大,细菌培养液浊度减小,表明壳聚糖抗大肠杆菌的活性随着其浓度的增大而提高. 当浓度变化范围为0~0.1%时,这种趋势尤为明显. 图4为壳聚糖脱乙酰化度与大肠杆菌培养液浊度的关系图. 在研究范围内,随着壳聚糖脱乙酰化度的增高,细菌培养液的浊度减小,表明壳聚糖抗大肠杆菌活性随着其脱乙酰化度的提高而增强. 壳聚糖的脱乙酰化过程,是其分子链上—NHCOCH3逐渐被—NH2取代的过程. 在酸性条件下,—NH2易与H+结合形成—NH+3正电离子,随着壳聚糖脱乙酰化度的增大,其分子链上的正电荷—NH+3也增多,对于细菌(带有负电荷)的静电引力增强,更多的细菌被絮凝,聚沉,其生