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海洋浮游微生物的培养 海洋占地球的70%以上。海洋微生物生活在一个特殊的海洋栖息地中，产生了许多独特的代谢能力，可以产生大量的自然生态微生物所无法吸收的活性物质。在过去的20年间, 从陆生微生物 (如土壤放线菌等) 中发现新型生物活性物质 (如新型抗生素) 的速度越来越慢, 人们越来越多地把目光集中在海洋微生物上 (例如海洋放线菌、蓝细菌和黏细菌等) , 希望从中发现新型生物活性分子。Pommier等构建了世界上9个主要近岸海区海洋浮游微生物的16S rDNA克隆文库, 发现不同海区的微生物丰度和种类都存在较大的差异。要对海洋微生物的生理特性进行深入了解, 或者要了解基因组中某些基因表达产物的代谢途径, 必须对海洋微生物进行培养。然而, 目前大多数海洋微生物尚不能被培养, 其产生的天然产物就无法筛选, 极大地限制了海洋微生物的应用。在细菌域的53个门 (按照环境16S rDNA序列划分) 中, 只有27个门中含有已被培养的微生物, 而另外的26个门仅知道其16S rDNA序列。到目前为止, 仅发现5个门, 即放线菌门、拟杆菌门、蓝细菌门、变形菌门和厚壁菌门中的一些种类能够产生生物活性物质, 而这5个门中已培养和报道的种类占所有已培养和报道的细菌种类的95%。据统计 (截至2008年7月) , 目前仅有约8 500种细菌被培养和正式报道。因此, 需要大力开发海洋微生物培养新技术, 尽可能多地培养海洋微生物。 1 直接活菌镜检计数法 基于16S rDNA序列分析的研究方法显示, 海洋中的绝大多数微生物都未获得纯培养。Kogure等用直接活菌镜检计数法 (direct viable count, DVC) 发现海水中90%以上的细菌都是活的, 但是在培养基平板上却仅有少数的细菌 (0.01%~0.1%) 能形成可见的菌落。大多数海洋微生物不能获得纯培养的原因可能是多方面的。 1.1 铁n-acyl-homotering和c8-hcl 许多海洋微生物与其他海洋生物/微生物处于共生状态, 或其生长受周围其他海洋生物/微生物代谢产物以及一些其他生长因子的影响, 离开原生态环境则难以生长。如:铁是所有微生物的一种必需元素, 而实际上海水中的铁浓度非常低 (0.4 μmol/L) , 并且只有极少数海洋细菌能够产生从环境中获取铁的铁载体 (siderophores) , 这是一种小分子量铁螯合化合物。Guan等发现, 当向含低浓度铁 (含0.1 μmol/L Fe (Ⅲ) ) 的培养基中加入外源的铁载体和C8-HSL (辛酰基高丝氨酸环内酯) 时, 原本在低浓度铁培养基上不能生长的海洋细菌也能形成菌落。这说明本身不能产生铁载体的海洋细菌在其他能产生铁载体的细菌存在的情况下也能从环境中获取铁, 这是微生物之间的一种共生关系。另外, 在饥饿状态下大多数微生物基因表达所涉及的cAMP、与大多数革兰氏阴性菌的密度感应系统 (quorum sensing) 密切相关的酰基高丝氨酸内酯 (N-acyl-homoserine lactones, HSLs) 分子等都可能是细胞之间沟通的信号分子。最近, 人们又发现一种光合细菌——沼泽红假单胞菌 (Rhodopseudomonas palustris) 密度感应系统的信号分子是p-coumaroyl-HSL。 实验室对海洋微生物的纯培养破坏了微生物之间的这种共生状态, 微生物之间的信息交流被阻断, 生长必需的信号分子和生长因子缺乏, 如许多海洋细菌离不开藻类分泌的生长因子和维生素, 表现为不可培养。 1.2 营养方面的影响 常规的海洋微生物培养基, 其营养物浓度远远高于微生物生长的自然环境。由于自然界中微生物数量庞大, 其可利用的营养物质极其匮乏, 多数处于“寡营养”状态。常规纯培养对这种认识不充分, 高浓度的营养物质可能比较适合于那些生长速度快且对高浓度营养物质有抵抗能力的微生物, 但是对那些生长速度较慢的微生物可能有抑制作用。对这些微生物提供营养成分丰富的培养基反而会成为阻碍其复苏的重要因素, 甚至会出现底物加速死亡 (Substrate accelerated death) 现象。 同时, 实验室培养无法完全模拟海洋环境, 传统的平板培养和液体震荡培养方式与微生物的原始生活环境差距太大, 所设定的生长温度也不一定是微生物最适的生长温度, 所以在自然界中可以生长繁殖的微生物, 在纯培养中生长条件得不到满足, 从而导致了微生物的不可培养性。 1.3 生长产生氧化合物 当海洋中的微生物从自然环境突然转入人为环境时, 一些对新环境适应能力较强或生长较快的微生物很快形成肉眼可见的菌落, 这些生长快的微生物会产生大量过氧化物、自由基和超氧化物, 这些物质的存在使那些适应能力较差或生长较慢的微生物细胞受到损伤, 从