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四物汤及其提取物对辐射致小鼠造血损伤的作用机制 血虚证是中医临床上常见的综合征之一。血虚证的生物模型包括辐射辐射、药物诱导、营养性饥饿和出血。笔者已成功地利用射线诱导制成实验性血虚证小鼠。进一步的研究结果表明:射线照射小鼠可导致CD34+细胞在骨髓有核细胞(BMNC)中的比例降低;骨髓细胞凋亡、周期紊乱;小鼠骨髓中粒系(CFU-GM)、红系(BFU-E,CFU-E)、巨核系(CFU-Meg)、混合系(CFU-Mix)造血祖细胞的数量下降;外周血细胞数量下降。四物汤是治疗中医血虚证的首选药,为临床补血、活血、调经之良方,但其物质基础和作用机制尚未完全阐明。本实验观察了四物汤及其提取物对射线诱发血虚证小鼠造血系统改变的影响和有效单体芍药苷对骨髓基质细胞因子分泌的影响,旨在探讨该药治疗血虚证的物质基础和作用机制 1 材料表面 1.1 动物 C57BL/6J小鼠80只,6～8周龄,体质量(20±2)g,雌性;由军事医学科学院实验动物中心提供,常规饲养。 1.2 药物、药品和仪器 Trizol试剂盒和SuperscriptⅡ反转录试剂盒购自Gibco BRL;Cy3-dUTP,Cy5-dUTP来自Amersham Pharmacia Biotech;IMDM培养液购自GIBCO公司。四物汤组方中生药药材均购自北京同仁堂制药厂。台式低温高速离心机(Sigma);DU640核酸蛋白紫外检测仪(Beckman);恒温水浴箱(北京长风);Gene Pix4000B扫描仪(Axon);Pixsys 7500芯片点样仪(Catesian Technologies);自动血球计数仪(Sysmex-820)。 1.3 等效剂量的计算 四物汤由熟地黄、当归、白芍、川芎组成,按《太平惠民和剂局方》规定剂量称取:熟地黄15,当归10,白芍10,川芎6,共计41。按《中药药理研究方法学》计算小鼠的等效剂量为10 g/(kg·d)。经水煎、过滤、浓缩,配制成100%四物汤总提物,即每mL药液相当于1 g生药。在四物汤水提物逐步加乙醇至乙醇浓度为80%,离心得到的沉淀为四物汤的80%醇沉提取物,上清为四物汤的80%醇沉上清提取物,将80%醇沉上清提取物浓缩至无乙醇味得到浸膏,加水溶解后分别以乙酸乙酯、正丁醇萃取,每种溶剂萃取3次,萃取液浓缩分别得到乙酸乙酯提取物,正丁醇提取物,余下的药液浓缩得到水溶提取物,上述药液和提取物置4℃保存备用。 1.4 次照射,剂量大,剂量低 实验动物分8组,模型制作方法参考文献:小鼠常规饲养数天适应环境后,采用60钴γ射线全身1次照射,照射剂量为3.5 Gy,剂量率为1.31 Gy/min,照射时间为2 min 40 s,受照射小鼠70只。模型制作后连续灌胃给药7 d,四物汤给药剂量为10 g/(kg·d),各提取物按在四物汤中的含量分布进行给药,实验的模型组和正常组则给予等体积的生理盐水。 1.5 细胞培养和药养 骨髓基质细胞系(HFCL),用含10%胎牛血清的IMDM培养液培养,置37℃、5%CO2孵箱中培养,细胞培养至细胞约占瓶壁面积的80%后,加入终浓度为4 mg/L的芍药苷。继续培养12 h,收集细胞,提取总RNA。 2 方法 2.1 外周血象检测 给药后第5、7、9、12 d,每只实验小鼠尾静脉取血20μL,用Sysmex-820自动血球计数仪检测外周血象,给药后7 d尾静脉取血涂片经瑞氏染色后,在显微镜下数100个白细胞进行细胞分类。 2.2 血肿培养 2.3 反转录ro 以总RNA为模板,用Cy 3/dUTP掺入合成cDNA第1链。反转录反应为:总RNA 70μg;Oligo dT16(0.5 g·L)5μL。混匀后立即70℃热变性10 min,冰浴2 min后依次加入:5×RT buffer5μL,0.1mol/L DTT2.5μL,RNasin(40 U/μL)1.0μL,dNTP Mix(1 mmol/L)1μL,Cy3/dCUP(1 mmol/L)1μL,SuperscriptⅡreverse transecripase(200 U/L)1 L,用MilliQ纯水(0.1%DEPC处理)定容至25μL。混匀后42℃水浴反应2 h。 反转录反应完毕后,整个体系于70℃水浴15 min灭活反转录酶;加入(NaOH),并于65℃水浴30 min降解RNA;最后冰浴条件下加入HCl中和,加入冰浴的无水乙醇沉淀cDNA。1%琼脂糖电泳鉴定反转录产物。最后产物溶于3×SSC杂交液中备用。 2.4 基于hfcl细胞的逆转轴杂交 制备好的芯片依次用0.2%SDS溶液洗涤约1 min,纯水洗涤0.5 min,室温无污染晾干。在芯片点样区上方覆盖适当大小的盖玻片。将已溶解的cDNA杂交探针在96℃水浴变性2 min后立即冰浴。将