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11高层半固体脂蛋白的制作 至于微生物研究，具体的研究材料是属于特定系统的微生物，即菌株。每株菌种性质各不相同,其基础的研究及其应用或关于病原微生物的研究也必须靠菌种重复实验结果。要使菌种长期保存,并遗传性质不变,必须选择更好更稳定保存方法,现介绍两种日常菌种保存方法: 1 材料和方法 1.1 保护剂、水剂、牛奶管 1.1.1 高层半固体琼脂 成份:蛋白胨1%,氯化钠0.5%,琼脂粉0.3%,pH7.4～7.6,在小试管中制成2/3以上高层半固体琼脂,15磅15min备用。 1.1.2 000号无菌橡皮塞 1.1.3 菌种管处理 先经清洁液浸泡,清水冲洗,肥皂水煮沸用自来水冲洗后,蒸馏水浸泡过夜,以达中性,然后管口塞上棉花,160℃C～170℃2h灭菌备用。 1.1.4 保护剂牛奶准备 从牛奶场直接接取原牛奶,经3000r/min离心,脱脂棉过滤,反复3次脱尽脂肪,10膀10min灭菌,保存冰箱备用。 1.1.5 冷冻干燥机,真空泵。 1.2 方法 1.2.1 冷冻干燥保存菌种的制备 将保存菌种经平板分离后,挑取菌落接种到高层半固体琼脂中经12h孵育,取出室温过夜,次日以无菌操作,换上000号无菌橡皮塞,置室温保存(冬天适宜放在15℃左右孵箱中),可保存20年,10年转种一次。1.2.2冷冻干燥保存菌种将保存菌种分别接种在对该菌最适宜斜面或平板上,经37℃C18h孵育后,用接种环刮取满满在三个白金环放入上述1ml已脱脂牛奶中轻轻磨匀,充分混和约以80亿为宜,然后用无菌长颈滴管吸取菌悬液滴入菌种管球部,每管4滴,用消毒眼科镊子抽取管口棉花少许,塞入管内细颈外,以松为好。放入低温冰箱-40℃速冻40min,取出后以最快速度连同干燥器放入冰酒精锅中,接上真空泵,真空抽干,(先保持冷温真空抽约2h后,弃去冰酒精锅,干燥器内菌种在室温中继续抽约6h。或者菌种经过-40℃低温速冻40min后取出直接放入冷冻机中真空抽干约6～7h。然后在真空条件下火焰封口,保存期15年～18年再转种一次。 1.2.3 分离、培养、干燥小鼠结肠岩石 a:试管传代法,按5%～10%接种量将钩体菌种接种在8%兔血清磷酸盐缓冲液半固体中28℃培养5d～7d,待生长丰盛后,用喷灯火焰封口,置室温暗处保存(且放在18℃～20℃中保存)一年转种一次。 b:冰冻干燥保存:保护剂5%蛋白胨,7.5%乳糖,1%白蛋白用10%磷酸钠调正pH7.2～7.4 8磅30min灭菌备用。将钩螺菌种接种于8%兔血清磷酸盐培养基中经28℃～30℃培养7d～9d后,用10000r/min离心30min或40000r/min 1h弃去上请,留下培养物为原总量1/80左右(每暗视野约2000条)再与保护剂等量混合,分装0.2ml球形菌种管内,置于干冰与酒精溶液中速冻(60℃～-70℃)2～4min,取出后放入干燥器中按上真空泵(温度继续保持-17℃～-21℃)经过6h～8h真空抽干,在真空条件下,用火焰封口。 冰冻干燥小肠结肠炎耶氏菌。 保护剂:先将细菌接种在2.5%心浸汁肉汤(HIB)琼脂平板上,通过初次肉汤传种,取其1ml,接种于100mlHIB中于32℃振摇培养48h,取其次代培养物加等量6%乳糖混和,分装菌种管球部,速冻40min后放入干燥器中接上真空泵6h～7h真空抽干,然后真空条件下火焰封口。 2 菌种保存方法 2.1 我们用高层半固体琼脂保存的926株菌株存放6年以上,除2株菌株因玻管口破损,琼脂干涸而死亡,几乎菌株全部存活。存活率可达99.8%。 2.2 762株菌株采用冷冻干燥保存,大部分菌株可保存15年以上(除了流脑、乙链、钩螺等),存活率可达96.4%以上。 2.3 以往菌种保存常用半固体琼脂,再加上液体石蜡,3个月移种一次,对于大量菌株保藏,既不经济,手续繁复,菌株容易污染,并发生变异,经过几十年观察,认为采用以上两种方法保存菌种是可行的,但需撑握以下几个关键因素。 2.3.1 高层半固体琼脂保存菌种,所用培养基成分不宜太好,营养成分过高,促使细菌生长繁殖迅速,代谢旺盛,可加速细菌死亡。此法简便,适宜于基层实验室应用(北京流研所用此法保存可达20年)。 2.3.2 冰冻干燥保存菌种 a:冻结温度需在共融点以下,为-25℃,此时蛋白质、盐类、细菌、水分等都同时冰冻,能保持物质原来分子结构,使有生命物质不致于受冻结影响而死亡。 b:当菌种管放入低温冰箱速冻40min后取出接上真空抽气,动作要快,不能使冰冻菌液受热融化,如已融化不宜再用,因反复冰融易使细菌死亡。此法保存菌种也是目前最常用方法,保存时间长,不易变异,一般能保存15年～18年以上,启封后有96.45%菌能直接复苏,还有4.55%菌株需增菌后复苏,也适宜于多种细菌保存。 钩端螺旋体菌种保存: