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PI（碘化丙啶）染色实验

【实验步骤】

一、细胞培养与收集

1、将对数期的细胞接种于6孔板中（2×105个/孔，根据细胞大小、增殖速度适当调整），每孔加2ml培养基培养，分别加入培养基配置的不同浓度药物1ml孵育。

2、药物作用结束后，悬浮细胞直接离心（1500rpm，4min）收集细胞，用预冷PBS洗细胞2-3次；

而贴壁细胞，用胰酶消化后，轻柔吹打细胞，避免细胞受损、细胞黏连；离心弃上清（1500rpm，4min），用预冷PBS洗细胞2-3次，以去除培养基、药物残留及细胞碎片。

3、细胞沉淀中加入少量PBS，轻柔充分重悬细胞。然后将重悬的细胞加入到4℃预冷的70％冰乙醇中固定，轻轻吹打均匀（切记！！！不要将冰乙醇加入到细胞中，这样会造成细胞黏连，严重影响结果），封口膜封口，4℃过夜。

二、细胞染色与检测

1、从冰箱中拿出细胞，2000rpm离心4min，去上清液，PBS洗两次，去上清液。

2、100ul100ug/mlRNaseA和0.2%TritonX-100重悬细胞，37℃水浴中30min

3、加入400ul50ug/mlPI，涡旋振荡混匀，室温避光孵育30min。

4、流式细胞仪检测细胞周期，一般计数10万个细胞，在激发波长488nm波长处检测红色荧光，而后用FlowJo软件分析细胞周期时相分布，分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除粘连在一起的细胞。

注意：上机检测时，必须重悬成细胞悬液再检测，否则容易堵仪器管道；如果细胞过多或聚团严重，可先用300目（孔径40-50um）尼龙网过滤，再上机检测。