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免疫组化之疑难解答及实战经验

Q1：冰冻切片和石蜡切片如何取材？

Answer:冰冻切片取材可分为两种情况，动物灌流固定和直接取材，石蜡切片是使用10%福尔马林溶液固定。

动物灌流固定：如小鼠心脏灌流，首先采用预冷的1×PBS灌流冲洗直至血液全部放出，随后灌注4%PFA（多聚甲醛溶液）直至小鼠僵直，而后解剖获取组织，于4℃、4%PFA中固定1h左右，1×PBS洗5次（30min/次），25%蔗糖溶液脱水12h左右包埋即可。

直接取材：直接选择新鲜组织进行冰冻切片，此时不需要进行抗原修复。缺点：切出的片子含水量会比较多，形成冰晶影响结果，而且后期的丙酮固定也会改变细胞的形态。

石蜡切片取材：动物组织取材（灌流与否都可以，并不影响后续的操作）后，置于10%福尔马林溶液中固定3-4天后，脱水，包埋，即可进行石蜡切片操作。

Q2：冰冻切片和石蜡切片的区别比较

Answer:

1.冰冻切片较厚（8-12μm），操作简单，抗原活性好，但是保存时间短，且一定放在-80℃的低温冰箱中。

2.石蜡切片制备过程较复杂，抗原活性差，但切片薄（3-5μm），便于观察细胞的细微结构，且常温保存即可，非常方便。

Q3：一抗的选择要点是什么？

Answer:

1.一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对低；而多克隆抗体特异性弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可通过封闭来避免）。

2.抗体的比例可依据抗体说明书或westernblot的抗体比例来做即可。

3.对于组织样本，一般要在37℃孵育1-2h或4℃冰箱孵育过夜（效果最佳，且拿出后需37℃复温45min），并保持湿盒里的湿度来防止抗体蒸发。对于难以着色的，在第二天还需将湿盒置于室温孵育。

Q4：如何选择封闭血清？

Answer:封闭血清一般是和二抗同一来源，可封闭非特异性结合位点，降低背景噪音。也可使用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗的来源一致。

Q5：DAB显色时间如何把握？

Answer:可选择一张阳性的片子，用计时器精确计时，在显微镜下判断出具体时间后，再对所有片子进行显色，采用相同的时间来界定。一般如果抗体浓度适宜，操作无误，10分钟内肯定能够显色，如果超过该时间，说明一抗比例不够或者封闭太久等等原因。显色时间越短，则说明抗体浓度高或抗体孵育时间过长，需下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间。

Q6：IHC复染时间的选择？

Answer:苏木素复染时间一般为5min左右，可调整，染色时间太浅，可延长时间，反之缩短时间；随后进行盐酸酒精分化，数秒即可，自来水洗，最后置于氨水中返蓝。

Q7：免疫组化的结果如何分析？

Answer:1.对照组必设。如阴性、阳性及自身对照。

由表中可知，只有6、7实验结果有意义。1-5均因对照组的结果已否定抗体的特异性或因ICH技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，则必须重复实验或换用抗体。

2.阳性着色细胞计数法。在40倍光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3-6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。

3.灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用imagej进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。

4.分级法。免疫组化的半定量一般分为三级：弱（+），中（++），强（+++）。以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光。弱（+）=1，中（++）=2，强（+++）=3。至少随机观察5-10个HPF。然后根据（+）%x1+（++）%x2+（+++）%x3计算出数值；总数值1.0者为（+），1.0-1.5者为(++),1.5者为(+++)。

Q8：IHC常见的疑难杂症有哪些？

Answer:

免疫组化（IHC）的实战经验

1.把要做的切片先分好，做几个抗体可分几盒，不正常组织与正常组织要分开。其余做预实验用。

2.选择实验要做的抗体时，要结合他们的正常组织和癌组织的分别表达率。

3.试剂盒的选择可结合生物素强弱的情况。如：肝组织生物素含量高，S-P试剂盒生物素含量也高，故不能配合使用。

4.每次开始做时，都必须先清点实验的必需品是否齐全。想好可能发生的意外，并先想好补救措施。当抗体不够用的情况下，原先买的抗体最好不要用完，留做可能需要的验证试验。新的抗体要尽量同公司，同批号。

5.烤片（单一或综合）程度要适情况而定，可中途拿出甩一甩，尽可能先放在烤箱里烤3小时以上。切勿把片烤得太久了。程度刚好，脱蜡效果才会好。注意做好不同条件的切片标记。注意温度稳定，再烤片。

6.二甲苯脱蜡。温度过低时，可先把二甲苯整罐放进烤箱加热，或者可把片放在二甲苯里一起加热脱蜡，这样效果会更好；若温度适宜，那还是在室温下脱蜡，要不可能会适得其反。时