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大鼠脑缺血气虚血瘀证模型的建立与评价体系的建立

通过研究血瘀证及其相关的综合综合征，阐明了建立适应的动物模型的前提。随着血液抑郁症综合征和相关复合综合征的深入研究，适宜的动物模型已成为必须尽快解决的优先问题。本研究在病证结合研究、根据病因建立证候动物模型等指导思想下,以常见疾病缺血性中风的主要证候气虚血瘀证为切入点,采用持续力竭性游泳复合线栓法制备缺血性中风气虚血瘀证大鼠模型,观察模型鼠在表征、舌象、血液流变学及脑组织形态学改变等几方面指标的变化,建立该模型评价体系。

材料和方法

1实验分组和手术

健康雄性SD大鼠36只,体重(220±10)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证编号:SCXK(京)2002-0003。随机分成3组:空白对照组(8只),正常喂养22天;单纯大脑中动脉闭塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)对照组(12只),正常喂养21天,第22天进行线栓法手术,缺血2h再灌注24h;复合模型组(16只),持续力竭性游泳21天,第22天进行线栓法手术,缺血2h再灌注24h。

2其他常用化学试剂

凝血酶时间(thrombintime,TT)测定试剂盒、凝血酶原时间(prothrombintime,PT)测定试剂盒、活化部分凝血活酶时间(activatedpartialthromboplastintime,APPT)测定试剂盒、纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)定量测定试剂盒(由宣武医院神经药理学实验室提供);其他常用化学试剂(北京化学试剂公司)。

DMS-3Morris水迷宫系统(中国医学科学院药物研究所);数码照相机(富士FinePixS9500);高速冷冻离心机(EpendorfCentrifuge5810R);全自动自清洗血流变仪(普利生LBY-N6B),红细胞变形/聚集仪(普利生LBY-BX),血小板聚集仪(普利生LBY-NJ4),高性能血凝仪(普利生C2000-2型);脱水机(LEICAASP300),石蜡包埋机(LEICAEG1150H),手动石蜡切片机(LEICARM2135),正置荧光显微镜(OlympusBX51)。

3mcoa局灶性脑缺血再灌注模型的建立

根据中医学理论“劳则气耗”选择游泳力竭法制备大鼠气虚血瘀状态。将模型组大鼠按(4.0±0.5)%体重负重后分批放入一内径150cm、水深40cm的圆形游泳池,水温控制在(20±1)℃,强迫其不停游泳直至力竭后捞出。力竭指征为游泳动作失调、水淹没鼻尖、身体下沉超过10s不能浮出水面。刚从水中捞出的大鼠呈疲惫无力状,表现为目微闭,以后肢撑地慢慢抬起前肢以立身,大喘,摇晃甚至后倒,多不动或挪步蹒跚,无力抵抗、一触即倒,游泳时间较长者常侧倒不能起,甚则双后肢痉挛呈后伸姿势伏地,以上表现可视为单次力竭表征,即证明游泳达到力竭。先适应性游泳训练3天,然后每天力竭性游泳1次,持续21天。

改良Z-longa线栓法建立MCAO局灶性脑缺血再灌注模型。于术前8～12h将复合模型组及单纯MCAO对照组大鼠禁食、自由饮水,术时以10%水合氯醛按0.35mg/kg体重腹腔注射麻醉,颈部备皮,沿颈正中线切开皮肤,钝性分离肌群,分离出左侧颈总动脉(commoncarotidartery,CCA)及颈外动脉(externalcarotidartery,ECA),结扎ECA和CCA近心端,于CCA分叉处备线;以动脉夹暂时夹闭CCA分叉处,于CCA结扎上方剪一小口,插入头端烫圆(直径0.28mm)的尼龙线,轻轻结扎备线固定栓线于血管内,开放动脉夹,将栓线推入颈内动脉(internalcarotidartery,ICA),使其头端到达大脑中动脉(middlecerebralartery,MCA)起始处[距CCA分叉处约(19±1)mm],扎紧备线,缝合皮肤。将术后大鼠置于电热毯保持体温,术后2h将栓线拉出以恢复MCA血流供应实现再灌注,回笼饲养。于再灌注6h进行Z-longa评分,评分在1～3分的大鼠认为模型制作成功,否则视为造模失败,弃之不用。于再灌注24h取材。

4观察和测试

4.1术后观察及评价标准

(1)体重:每5天称量1次并记录,以xˉ±sxˉ±s表示;(2)进食量:每天记录前日饲料剩余量及当日投入量,计算平均体重每日进食量=(投入量-剩余量)/总体重;(3)夜间活