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一株产淀粉酶细菌菌株的筛选和选育

陈斌

(南京师范大学生命科学学院2009级生物工程(制药))

摘要：从南京地区的土壤中筛选到一株产淀粉酶的细菌菌株C-1。形态及生理生化特征测定结果表明，C-1菌株与芽孢杆菌属(Bacillaceae)中的枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisCohn)种的特征基本一致。测定了该菌株的16SrDNA序列并根据16SrDNA构建了系统发育树；在系统发育树中，C-1菌株与枯草芽孢杆菌形成一个类群，序列同源性为99%。因此将C-1菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。

关键词：淀粉酶，产酶，细菌，枯草芽孢杆菌

提前

提前24h平板菌种接液体试管活化，并接种一支斜面试管保藏。提前3h按0.5%接种量分别转接如下五种液体

芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。早在1835年，Ehrenberg所描述的“Vibriosubtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn于1872年正式命名的，现作为芽孢杆菌属(Bacillaceae)的模式菌株［1］。从生物学特性来讲，枯草芽孢杆菌具有典型的芽孢杆菌特征，其细胞呈直杆状，大小(0.8-1.2)pmx(1.5-4.0)pm，单个，革兰氏染色阳性，着色均匀，可产荚膜，运动(周生鞭毛)；芽孢中生或近中生，小于或等于细胞宽，呈椭圆至圆柱状；菌落粗糙，不透明，扩张，污白色或微带黄色；能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型好氧菌［2］。

1997年，KunstF.等人首先完成了枯草芽孢杆菌的完整基因组序列测定，并将结果发表在《Nature》杂志上［3］。

工业酶的生产是工业微生物发酵的重要组成部分。据来自BBC的统计数字，2004年全球酶的交易额达到20.0亿美元(15.3亿欧元)，其中食品酶占29%，饲料酶占15%，一般的工业酶占56%。枯草芽孢杆菌是当今工业酶生产应用最广泛的菌种之一，据不完全统计，枯草芽孢杆菌所产的酶占整个酶市场的50%。由于其产酶量高、种类多、安全性好和环保等优点，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种，其发酵生产的酶已在食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸和医药等领域均发挥着十分重要的作用。

枯草芽孢杆菌生境多样，可利用的营养物质种类十分丰富，这决定了其自身含有丰富的产酶系统，具备生产多种酶的应用潜力。研究资料表明，枯草芽孢杆菌能够产生蛋白酶、a2淀粉酶、纤维素酶、。2葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等十几种酶［4］。枯草芽孢杆菌生产的蛋白酶、淀粉酶是工业酶中应用最为广泛的酶，仅二者就占到了整个工业酶市场的50%［5］。其中，淀粉酶的生产和应用处于整个酶制剂的首位，其最早是在20世纪初，由德国的Boiden和Effront先后从枯草芽孢杆菌培养液中分离出的；蛋白酶主要用于制革、丝绸工业及制造加酶洗涤剂等方面。

1材料和方法

材料

菌种来源：筛选的土壤来自南京师范大学仙林校区北苑37栋门前绿化带。

培养基：筛选培养基A：每升含牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，pH4.0。筛选培养也：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，pH7.2。筛选培养基。淀粉3g，蛋白胨10g，K2HPO41.5g，MgSO4-7H2O1.5g，pH7.2。筛选培养基D：葡萄糖3g，蛋白胨10g，K2HPO41.5g，

MgSO4?7H2O1.5g，pH7.2。筛选培养基E：硝酸钠10g，葡萄糖3g，K2HPO41.5g，MgSO4?7H2O1.5g，pH7.2。筛选培养基F：蛋白胨10g，葡萄糖3g，K2HPO41.5g，MgSO4?7H2O1.5g，pH7.2。

仪器：Smart3000型分光光度计购自Bio_Rad公司，3K30高速冷冻离心、机购自$igma公司，HD_930型全温摇床购自博莱特仪器厂，LC_MSD_Trap_SL_01100液质联用仪购自Agilent公司，PTC_100型PCR仪购自MJResearch公司。

菌种筛选

称取土壤2甘，放入18mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，振荡5min，静置5-10min。取上述10-1稀释度的土壤悬液1ml加入灭菌离心管中，在80°C水浴锅中水浴10min，在1.5ml灭菌离心管中依次稀释至10-2、10-3、10-4稀释度。取上述10-2、10-3、10-4稀释度的菌悬液分别涂布平板。30C培养24h。用记号笔标记单菌落，挑取单菌落划线至另一平板上并做好标记(确保两块平板上的菌落一一对应)，在原平板上菌落周围滴加路哥氏碘液，测量菌落大小(C)和水解圈大小(H)。挑取1个产淀粉酶的菌落，进行进一步划线分离纯化。30C培养7天。

不同条件对产酶的影