2011年基因工程大实验讲义.docVIP

各位同学：

本学期的植物基因工程实验定于第十一周的周一至周六（10.31-11.5日）在综合楼513室进行。望各位同学提前打印好实验讲义，并在每次实验之前对相应实验内容做好充分预习。

（实验讲义内容及日程安排见网络教学平台。

用户名2009chenshihua

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具体实验试验内容如下：

大实验一目的基因的克隆（共计8学时）

实验一Trizol试剂快速提取植物总RNA（4学时）

实验二反转录PCR（4学时）

实验三目的基因的PCR扩增（中间穿插准备下次实验相关材料）（4学时）

大实验二表达载体的构建（共计24学时）

实验一琼脂糖凝胶电泳检测、PCR扩增基因产物的回收及重组载体的构建（4学时）

实验二大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）（4学时）

实验三质粒（重组载体）转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的筛选（4学时）

实验四质粒（碱法）提取及电泳检测（4学时）

实验五重组载体（质粒）的酶切和电泳检测（4学时）

大实验三目的基因的遗传转化及分子筛选/检测（共计16学时）

实验一植物转基因操作：渗透法转化拟南芥及转化子筛选（4学时）

实验二植物基因组DNA的提取及电泳检测（4学时）

实验三转基因植物的PCR检测（及转基因动植物相关检测方法介绍）（4学时）

实验四β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS）组织化学染色检测转基因植物（4学时）

基因工程综合实验具体日程安排：

周一上午：总RNA（Trizol试剂）快速提取

周一下午：RNA电泳检测及反转录PCR

周二上午：目的基因的PCR扩增（中间穿插准备后面实验用的LB培养基）

周二下午：琼脂糖凝胶电泳检测并回收PCR扩增基因产物及重组载体的构建

周三上午：大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）

周三下午：质粒（重组载体）转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的筛选

周四上午：植物基因组DNA的提取及电泳检测

周四下午：转基因植物的PCR检测（及转基因动植物相关检测方法介绍）

周五上午：质粒（碱法）提取及电泳检测

周五下午：重组载体（质粒）的酶切及电泳检测

周六上午：植物转基因操作技术：渗透法转化拟南芥及转化子筛选

周六下午：β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS）组织化学染色检测转基因植物

目录

实验一Trizol试剂快速提取植物总RNA

实验二反转录PCR（RT-PCR）

实验三琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物（DNA）

实验四从琼脂糖凝胶中回收（PCR产物）DNA片段

实验五DNA片段的连接（向质粒载体中插入外源DNA）

实验六大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）及活性检测

实验七质粒转化

实验八、九质粒（碱法）提取及重组质粒（重组子）的筛选和酶切检测

实验十渗透法转化拟南芥及转化子筛选

实验十一植物基因组DNA的提取及转基因植物PCR检测

实验十二转基因植物的PCR检测

实验一Trizol试剂快速提取植物总RNA

实验目的

学习用试剂盒从植物组织中提取总RNA的方法。

实验原理

RNA是一类极易降解的分子，要获得完整的RNA必须在提取过程中最大限度地抑制内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解作用。高强度变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA，蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA，LiCl可以选择性的沉淀RNA，使RNA进一步得到纯化。

TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。

焦碳酸二乙酯（DEPC）：一种高活性的烷化剂，通过组胺基团的乙氧基甲酸化形式破坏RNase活性。因此常用于灭活缓冲液和玻璃器皿中的RNase。

抑制RNase的活性：准备溶液时使用无RNase的玻璃器皿、DEPC处理过的水。180-300℃

实验仪器、材料与试剂

（一）仪器

低温