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临界点干燥法

1、 取材：组织块一般长宽小于10mm，高度小于5mm,细胞、真菌等附着性样品直接培养在盖玻片上（5mm*5mm大小的玻片），细菌、藻类等微小样品的处理方法见附件1，血液或组织液直接在盖玻片上制成薄涂片。

2、 固定及清洗：

2.5%戊二醛，4吒冰箱固定1.5小时或更长时间。

用0.1M磷酸缓冲液漂洗20minx3次。

3、 脱水：

30%乙醇5min

50%乙醇5min

70%乙醇10min，可4吒冰箱过夜。以上操作在冰盒里进行。

80%乙醇10min

95%乙醇15min

100%乙醇（无水硫酸钠处理）15minx2次

4、 临界点干燥

5、 喷金

6、 扫描电镜观察，拍片。

磷酸盐缓冲液（三个步骤）

1.磷酸盐缓冲液（0.2M）

甲液：0.2M的磷酸氢二钠溶液

乙液：0.2M的磷酸二氢钠溶液

Na2HPO42H2O

35.61g

NaH2PO4H2O 27.60g

(Na2HPO47H2O)

53.65g

(NaH2PO42H2O)31.21g

(Na2HPO412H2O)

71.64g

加蒸馏水溶解成

1000ml

加蒸馏水溶解成 1000ml

2.按下表混合甲、乙两液既得所需pH的0.2M缓冲液（一般pH值为7.4）

0.2M磷酸盐缓冲液的配制

pH

6.4

6.6

6.8

7.0

7.2

7.4

7.6

7.8

8.0

甲液（ml）

26.5

37.5

49.0

61.0

72.0

81.0

87.0

91.5

94.7

乙液啊

73.5

62.5

51.0

39.0

28.0

19.0

13.0

8.5

5.3

将溶液用蒸馏水1：1稀释，则配得0.1M的缓冲液。

附件1：

细菌、藻类等样品的前处理方法

盖玻片泡酸，清洗，烘干。用剪刀剪碎，挑出5mm*5mm大小玻片备用。玻片过大或者过厚影响观察效果。

菌液或样品悬液离心，需要可进行清洗，加入固定液，吹散固定，于4度冰箱固定2小时左右。

固定结束后，去固定液，加入磷酸盐缓冲液浸泡清洗，10分钟。离心去磷酸盐缓冲液，固体沉淀根据量多少，加入适量磷酸盐缓冲液，制成浓度较高的悬液（目测较混浊）。样品浓度对后期吸附有较大影响，浓度过低可能吸附量会很少。

（1）以鸡蛋清作为黏附剂：取鸡蛋清，稀释3-5倍（一定要稀释！蛋清过浓会包裹样品），之前准备好的玻片放入液体内蘸一下，取出晾干至触摸感觉有点黏的状态（快干的状态）。将第3步取得的悬液滴在玻片上，吸附30秒到1分钟，用滤纸吸去多余液体（样品悬液在玻片上停留时间过长将导致样品被蛋清完全包裹而无法观察）。在玻片上滴加固定液，固定10分钟，固定后用PBS浸泡清洗10分钟。

（2）以Formvar作为黏附剂：将准备片放入0.5%Formvar蘸一好的玻下，取出晾干至触摸感觉有点黏的状态（快干的状态）。将第3步取得的悬液滴在玻片上，吸附30秒到1分钟，用滤纸吸去多余液体。

进行梯度脱水处理。

PS：（1）黏附剂二选一，根据实际情况选用，Formvar电镜室可以提供；

（2） 样品处理过程中，如果要较长时间停留，请在70%乙醇中停留，其他步骤不能长时间停留，特别是100%乙醇，以免过度脱水；

（3） 样品送过来临界点干燥时，请泡在100%乙醇中，不要暴露在空气中。

（4） 处理过程中有任何疑问，直接与仪器管理员联系。