肝糖原的测定提取.docVIP

实验名称

肝糖原的提取、鉴定与定量

实验日期

2014-12-25

实验地点

FORMTEXT第1实验室

合作者

FORMTEXT姜晨煜

指导老师

周珏宇

评分

教师签名

批改日期

20

一、实验目的

1.掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。

2.了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。

3.正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。

4.熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。

5.正确掌握溶液转移的操作。

6.正确操作使用分光光度计。

二、实验原理

1.实验一原理：

（1）肝和肌肉组织中糖原的含量最高，因此适于作糖原的提取与鉴定。

（2）用三氯乙酸破坏肝组织的酶且沉淀蛋白而保留糖原。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95%乙醇将滤液中的糖原沉淀，再溶于热水。

（3）糖原溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色，本身无还原性，在酸性溶液中加热可水解为具有还原性的葡萄糖。后者可将碱性铜溶液（班氏试剂，Benedictreagent)中的二价铜氧化成氧化亚铜。利用上述性质，可判定组织中糖原的存在。

2.实验二原理：

糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在(10~100)mg范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法（直接比较法）即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留肝糖原。

三、材料与方法：以流程图示意

（一）实验材料

1.实验器材

（1）普通离心机，室温~100℃恒温水浴箱（×1），722型分光光度计，托盘天平（×1

（2）剪刀（×1），镊子（×1），研钵（×1）

（3）试管架（×1），10mL离心管（×2），（100×15）mm试管（×6）

（4）刻度吸量管（2mL×1，5mL×2），1000μL微量可调取液器（×1）

（5）100mL容量瓶（×1）

（6）白瓷反应板（×1）

2.试剂与样品

（1）鸡肝。

（2）95％乙醇。

（3）0.31mol/L(5％)三氯醋酸溶液：称取未潮解的三氯醋酸（C2HCl3O2，163.39）5g，加蒸馏水溶解至100mL。

（4）0.15mol/LNaCl溶液：称取8.8gNaCl加蒸馏水溶解至1000mL。

（5）12mol/LHCl：浓HCl原液（36%~38%）。

（6）12.5mol/L(50％)NaOH：称取NaOH50g，用蒸馏水溶解至100mL。

（7）碘试剂：碘l00mg和K1200mg溶于50mL蒸馏水中。

（8）班氏试剂：称取柠檬酸钠（C5H5Na3O7·5H2O，294.10）17.3g和无水碳酸钠（Na2C03，105.99）100g溶于蒸馏水700mL中，加热促溶。冷却，慢慢倾人17.3％硫酸铜（CuSO4·5H2O，249.68）l00mL，边加边摇。再加蒸馏水至1000mL

（9）5.35mol/L(30％)KOH溶液：称取KOH30g，加蒸馏水溶解至100mL。

（10）标准葡萄糖液(50mg/L)：称取已干燥恒重的无水葡萄糖25mg，加蒸馏水溶解至500mL。

（11）17mol/L(90％)H2SO4：量取蒸馏水30mL，加浓H2SO4500mL。

（12）蒽酮显色剂：称取蒽酮0.20g，用17mol/LH2SO4溶解至100mL。此试剂不稳定，以当日配制为宜，冰箱保存可用4~5天。

（二）实验步骤

1.实验一步骤：

实验一流程如下图所示：

鸡肝约1.5g，剪碎

＋5%CCl3COOH1ml

研磨至乳状

＋5%CCl3COOH3ml

研磨成肝匀浆

全部转入离心管中，离心3分钟（4000r/min）

沉淀（弃去）上清（取3ml）

＋3ml95%乙醇，混匀，静置10分钟

离心5分钟（4000r/min）

上清（弃去）沉淀

＋蒸镏水1ml

沸水浴2分钟，溶解沉淀

白瓷板孔穴中糖原溶液1ml

＋浓HCl5滴

加碘试剂2滴加碘试剂2滴沸水浴15分钟，冷却

糖原溶液2滴＋50%NaOH5滴

呈色对比糖原水解液2滴糖原水解液

＋班氏试剂2滴

混匀

沸水浴2分钟，观察变化

实验一操作：

（1）肝匀浆的制备：称取约1g肝脏置研钵中，加入