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实用文档
质粒DNA的提取
一、实验方法
碱裂解法抽提质粒DNA
二、实验原理
基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。
分子大小
构型
pH12.6
pH4.8
质粒DNA
小
环状
变性不完全
复性
染色体DNA
大
环状
完全变性
不能复性
三、实验步骤
1）质粒提取
1.10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。
2.加入100ml溶液1，振荡至彻底悬浮。
3.加入200ml溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟
4.加入150ml溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。
5.将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。
6.将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA
7.10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟
8.倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇
9.加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA
2）质粒鉴定?琼脂糖凝胶电泳
灌胶：胶中加入荧光染料(SYBRGreenI)
加样：质粒+上样缓冲液?混匀
电泳
结果观察：UV灯下
四、实验结果
五、实验分析
裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质
1、防止DNA裂解：Solution1
1）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解
2）、所含EDTA抑制酶活性
2、溶解与变性：Solution2
1)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性
2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白
3、沉降与复性：Solution3
1)质粒DNA复性
2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀
预期结果为剩余质粒DNA
4、琼脂糖凝胶电泳
1）荧光染色
染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间
2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同
六、误差分析
实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。另一条，RNA-DNA杂交链？因染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间。因还有一条在亮带后，推测为染色体DNA，推测很大可能性是Solution3处时间过短，沉降不完全。
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