人羊膜间充质干细胞条件培养基改善视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤的作用及机制研究.pdf

摘要

摘要

目的：

探讨人羊膜间充质干细胞条件培养基（humanamnioticmesenchymalstemcell

conditionedmedium,hAMSC-CM）对视网膜色素上皮（retinalpigmentepithelium,

RPE）细胞氧化应激损伤的保护作用及分子机制，从而为寻找治疗视网膜氧化应

激损伤的新方法及新候选物提供理论依据。

方法：

1、人羊膜间充质干细胞（humanamnioticmesenchymalstemcell,hAMSC）

的培养及鉴定：利用酶消化法从人羊膜组织中提取并培养hAMSC。观察其形态，

并通过流式和免疫荧光实验检测其表面标志物。

2、hAMSC-CM对ARPE-19细胞氧化应激损伤的作用。利用HO构建

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ARPE-19细胞氧化应激模型，通过CCK-8和流式细胞仪检测hAMSC-CM对受

损ARPE-19细胞增殖活性和凋亡的影响。

3、hAMSC-CM对ARPE-19细胞氧化应激损伤的分子作用机制。（1）利

用荧光显微镜检测hAMSC-CM对HO诱导损伤的ARPE-19细胞线粒体膜电位

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（Mitochondrialmembranepotential,MMP）、活性氧（reactiveoxygenspecies,

ROS)水平的影响，激光共聚焦显微镜检测其线粒体形态变化，Westernblot检测

凋亡蛋白的变化，以确定hAMSC-CM对受损ARPE-19细胞线粒体凋亡途径的

影响。（2）分别加入PI3K抑制剂LY294002和Akt抑制剂TIC10，利用Western

Blot检测正常组、HO处理组、hAMSC-CM组以及抑制剂组中PI3K/AKT信号

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通路相关蛋白表达水平，CCK-8法检测各组细胞增殖活性，Calcein-AM/PI荧光

双染法检测各组细胞死亡情况，荧光显微镜检测各组线粒体功能，以确定

hAMSC-CM是否通过PI3K/AKT通路影响受损ARPE细胞线粒体凋亡途径。

4、hAMSC-CM中的外泌体对ARPE-19细胞氧化应激损伤的作用。利用超

速离心法提取hAMSC-CM中的外泌体（hAMSC-exo），通过电镜和Westernblot

对其进行鉴定，并进一步检测其对HO诱导损伤的ARPE-19细胞增殖活性与

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凋亡的影响。

结果：

II

摘要

1、hAMSC具有间充质干细胞特性。hAMSC呈纺锤形，表达胚胎干细胞标

志物OCT4和Nanog，表达间充质干细胞标志物CD90和CD105，不表达造血干

细胞标志物CD45和CD34，不表达主要组织相容性蛋白HLA-DR及共同刺激因

子CD80、CD40。

2、hAMSC-CM保护HO诱导损伤的ARPE-19细胞，抑制其凋亡。hAM

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SC-CM明显改善了受损ARPE-19细胞的活性，减少其凋亡数量。

3、hAMSC-CM通过PI3K/AKT信号通路调控线粒体凋亡途径，进而影响

受损ARPE-19细胞的活性和凋亡。hAMSC-CM有效抑制受损ARPE-19细胞

MMP的降低及ROS的生成，下调促凋亡蛋白Bax、Bim、CleavedCaspase3、

CleavedCaspase9的表达，上调抗凋亡蛋白Bcl2表达，并且影响线粒体形态。

4、hAMSC-CM可能通过外泌体影响PI3K/AKT通路，改善受损ARPE-1

9细胞增殖活