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基因突变检测的基本技术

基因诊断选择不同的技术，直接检测和分析样本中的DNA或RNA水平上的致病性突变，以协助遗传病的诊断、产前诊断、分类、预后和药物治疗等（表2-1）。样本只要包含任何有核细胞即可，包括外周血（最常用）、活检标本、羊水、绒毛、口腔黏膜、石蜡组织块、唾液、痰液、尿液、精液、毛囊等（详见“第三章遗传病诊断与遗传咨询”）。

表2-1DNA突变检测技术一览

续表

一、直接检测DNA突变的技术

（一）PCR

聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是最基本、最为广泛应用的DNA突变检测技术。PCR可以选择性地将单个DNA或RNA分子在几小时内迅速扩增至几百万倍以上，直接检测和分析患者特定基因的序列而不需要克隆及DNA印迹或RNA印迹分析的过程。从发根、漱口液及少量血痕中得来的极少数细胞均可以直接用于PCR分析，因而可以不必从组织中抽提大量的DNA或RNA样本。

PCR的原理是用一对能分别与靶DNA双链序列配对的人工合成的寡聚核苷酸引物，在耐热DNA聚合酶（Taq）的作用下扩增目的DNA片段（图2-8）。重复热变性、引物复性及延伸的循环，靶序列的拷贝数会按指数成倍增长（可达10?6～7?）。

PCR的操作流程如下：

（1）用加样器在Eppendorf反应管中加入下列成分：PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、引物混合液、基因组DNA模板、ddH?2?O。

（2）在设定好的PCR仪上进行反应：95℃变性3分钟（第一轮循环）；95℃变性30秒；56℃复性30秒；72℃延伸30秒；72℃延伸10分钟（最后一轮循环）。循环反应30轮（注意：复性的温度和时间依据靶DNA序列的长度和引物序列的不同而异）。

（3）反应结束后，取少许反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认是否有目的PCR产物。另外，DNA染色后，可将PCR产物条带的浓度同分子量标志（marker）条带的浓度进行比较，估算大致的DNA量。

图2-8PCR的基本原理示意图

PCR技术有快速、经济、灵敏度高以及对患者核酸检测的样本的要求低等很多优势。但由于PCR的强大扩增能力与检测的敏感性，极微量的污染便可导致假阳性结果。因此，临床实验室要特别重视避免PCR的产物被污染。

（二）实时定量PCR（qPCR）

自Mullis于1985年发明PCR技术以来，已经衍生出几十种相关的PCR方法，如多重PCR、原位PCR、RT-PCR、巢式PCR等。定量PCR的目的是以PCR终产物的量推测样本中待测靶分子的起始量和相对起始量，即检测样本中靶基因的拷贝数，故对研究基因的扩增和表达，以及疾病的预后具有重要意义。其中，又以实时定量PCR（real-timequantitativePCR，qPCR）的应用最为广泛。根据所用荧光技术的不同，qPCR可分为两类：①根据寡核苷酸探针与PCR产物结合后所释放出的荧光进行检测和定量，如TaqMan系统；②通过双链DNA亲和性荧光素与PCR产物结合后所释放出的荧光进行检测和定量，如SYBRGreen系统。

PCR反应的早期，每经过一轮变性、引物复性和延伸合成的周期，DNA分子的数量就会增加一倍。如果对这种相关性进行绘图，在半对数坐标纸上可以得到一个直线图形。达到一定的产量阈值（threshold）所需的PCR循环数是估测PCR起始模板数量的一个反映：达到一定产量所需的循环数越少，起始PCR的模板量越多。qPCR是相对于一个标本（内参照标本B）的待测标本（标本A）中特定DNA或RNA的定量分析，标本A与B扩增的效率应该具有可比性；即两条直线区段应该是平行的。以TaqMan方法为例，与普通PCR不同，除了含有2条普通的PCR引物之外，还有1条荧光标记的基因探针。探针的5′-端标记荧光报告基团（R），3′-端为荧光淬灭基团（Q）。当探针保持完整时，Q基团抑制R基团，无荧光信号。在PCR反应中，Taq耐热DNA聚合酶不仅具有延伸DNA引物的活性，而且具有5′→3′外切核酸酶的活性。随着PCR反应的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其外切酶活性将探针切断，R基团远离Q基团，Q基团的抑制作用消失，其能量不能被吸收，R基团的荧光信号便可被测到，被释放的游离R基团的数目和PCR产物的数量是一对一的关系，通过检测荧光信号的强度就可推算出PCR产物的量（图2-9）。

图2-9qPCR的原理

A.TaqMan技术；B.real-timePCR分析结果。随着PCR循环次数（X轴）的增加，PCR产物（Y轴，以荧光强度表示。Rn即校正后的报告基团荧光强度）呈指数性增长

（三）限制性片段长度多态性（RFLP）

限制性内切酶（restrictionendonuclease）简称“限制酶”，是能识别特定的DNA双链序列并能在识别序列