脱颗粒依赖的Mac1-ERK1_2-AKT信号介导BHB抑制SCK+奶牛中性粒细胞自发凋亡.pdf

中文摘要

脱颗粒依赖的Mac1-ERK1/2-AKT信号介导BHB抑制SCK奶牛

中性粒细胞自发凋亡

奶牛酮病是围产期奶牛高发的一种以能量负平衡（NEB）为病理学基础，

以高酮血症（主要酮体为β-羟基丁酸，BHB）和系统性炎性反应为病理学特征

的营养代谢病。根据有无临床症状以及血液BHB浓度可以分为亚临床酮病

（SCK，1.2mM≤BHB＜3mM）和临床酮病（CK，BHB≥3mM）。SCK

增加奶牛乳腺炎、子宫内膜炎和蹄叶炎等无菌性或感染所致炎症性疾病的发病

率，是临床上造成奶牛生产性能下降、繁殖障碍、使用年限缩短和淘汰的核心

能量代谢障碍性疾病。系统性炎性反应是SCK引发炎症性疾病和生产性能受

损之间的纽带，其成因尚不明确。

中性粒细胞作为先天免疫系统的第一道防线，具有强大的炎性放大功能，

并通过自发凋亡的方式限制其自身过度反应，在维持机体炎性反应平衡中起着

关键作用。中性粒细胞自发凋亡受阻时，大量细胞积累，分泌的促炎介质（包

括IL-6、髓过氧化物酶和活性氧等）加剧全身炎症。SCK奶牛的中性粒细胞

凋亡受阻与其系统性炎性反应发生密切相关。此外，胞内存活信号通路

ERK1/2和AKT及其下游Bcl-2家族介导的线粒体途径是中性粒细胞中重要的

凋亡调控机制。脱颗粒依赖的Mac1的活化也被证实可以调控ERK1/2和AKT

信号通路介导的中性粒细胞凋亡。本研究的目的是探讨BHB对SCK奶牛中性

粒细胞凋亡的影响及其内在调控机制。

体内试验结果表明SCK奶牛血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的

含量显著升高，急性期反应蛋白如血清淀粉样蛋白A（SAA）和触珠蛋白

（HP）含量显著升高，且与BHB浓度呈正相关，表明SCK奶牛存在系统性

炎性反应；使用AnnexinV-FITC/PI流式染色检测血液中性粒细胞凋亡情况，

结果表明SCK奶牛血液中性粒细胞凋亡率显著下降，且与血液中BHB浓度呈

显著负相关；与之一致的是凋亡相关蛋白caspase3的活化形式cleavedcaspase

I

3的蛋白表达丰度也显著下降，表明SCK奶牛中性粒细胞凋亡被显著抑制。在

体外试验中使用不同浓度、不同刺激时间的BHB处理中性粒细胞，流式细胞

术结果表明BHB可以显著抑制中性粒细胞的凋亡，且在2mM/8h条件下效

果最为明显，经BHB处理后cleavedcaspase3的蛋白表达丰度也显著下降，这

进一步确证了BHB对中性粒细胞凋亡的抑制作用。

BHB抑制中性粒细胞自发凋亡的相关机制研究中WB结果以及qRT-PCR

试验结果表明，BHB刺激后中性粒细胞促凋亡相关分子Bax（BAX）和Bad

（BAD）的蛋白表达丰度以及mRNA水平降低，抑凋亡相关分子Bcl-xL

（BCL2L1）和Mcl-1（MCL1）的蛋白表达丰度以及mRNA水平增加；与此相

一致，BHB处理后中性粒细胞线粒体膜电位水平维持在较高状态，提示BHB

抑制奶牛中性粒细胞自发凋亡可能由线粒体途径介导。BHB处理后中性粒细

胞胞内存活信号通路ERK1/2和AKT的磷酸化水平显著升高，在分别使用

ERK1/2和AKT信号通路抑制剂SCH772984和MK-2206处理后发现中性粒细

胞凋亡率显著升高；线粒体膜电位显著降低；WB结果以及qRT-PCR结果显示

SCH772984和MK-2206可以显著逆转BHB对中性粒细胞中cleavedcaspase3

以及线粒体凋亡途径相关蛋白表达的影响，表明ERK1/2和AKT信号通路参

与BHB抑制中性粒细胞自发凋亡的调节。有关BHB如何激活ERK1/2和AKT

信号通路的试验结果表明，BHB处理后中性粒细胞脱颗粒水平以及膜上Mac1

受体表达和活化水平均显著提高。当Mac1受体被阻断后，BHB对ERK1/2和

AKT信号通路的激活作用以及对中性粒细胞凋亡的抑制作用均被破坏。当中

性粒细胞脱颗粒被抑制后，BHB对中性粒细胞膜上Mac1受体表达以及活化的

增强作用则被扭转。综上所述，病理浓度BHB通过激活脱颗粒依赖的Mac1-

ERK1/2-AKT信号，抑制线粒体途径介导的SCK奶牛中性粒细胞的自发凋

亡。以上发现为SCK奶牛的系统性炎性反应