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植物硝酸还原酶（NR）活力测定（活体法）

于图一、原理

硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐,产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及蔡胺（或蔡基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。其反应如下：

N02-+2H++Cl-、CI-N=NC1-N=N

N02-+2H++Cl-、

CI-N=N

C1-N=N

+2HQ

+

SO3H NH2

SO3H

生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以NpggLh-i为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好

二、仪器与用具

分光光度计；真空抽气泵（或20ml注射器筒）；天平；单面刀片呆温箱（或恒温水浴)；刻度试管(15ml);移液管(5mlx2,2m1x8,lmlx2\

三、试剂

亚硝酸钠标准液称取分析纯NaNO20.1000g水溶后定容至100ml,吸取5ml用水稀释定容至1000ml,即为每ml含NaNO25pg(亚硝态氮近似lpg/ml)的标准液。

0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液:K2HPO419.24g,KH2Po42.2g,加水溶解后定容至1000mL

1%(W/V)对-氨基苯磺酸溶液：称取10.0g加入250ml浓HCI中，用蒸储水定容至1000mL

0.2%(W/V)a-秦胺溶液：称取2.0ga-蔡胺溶于250ml冰醋酸中，用蒸储水定容至1000mL

30%三氯乙酸溶液：75.0g三氯乙酸水溶后定容250mlo

KNO3(0.1mol/L\异丙醇(1%V/V\磷酸缓冲液(0.1mol/L)混合液：称10.10gKNO3溶于1000ml0.1mol/L的磷酸缓冲液中，再加10ml异丙醇混匀。

四、方法

.标准曲线制作

取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表13-1顺序加试剂，即配成0-2.0|jg的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在30℃保温箱或恒温水浴中保温30min,然后在540nm波长下

比色。以亚硝态氮(pg)为横坐标，光密度值为纵坐标绘标准曲线或建立回归方程。

表13-1各试剂加入顺序

年号

1

■

■

6

哈螂的标腕

0

02

04

0.1

U

1.6

2.0

2.0

11

1.6

U

0.1;

?4

0

IX对-冢基茉谓酸

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

每旧。二州

0

0.2

0.4

0.S

1J

1.6

2.0

.酶反应和酶活性测定

(1)取样：将材料(小麦、玉米等作物叶片)洗净，用蒸储水冲洗，滤纸吸干。在叶片中部打取直径1cm的圆片(或剪成0.5~1.0cm2的小块)，混匀后每个样品称0.3g3份,放入试管并编号。

(2)反应：向各试管加入KNO3?异丙醇?磷酸缓冲液混合液9ml,其中一管立即加1.0ml三氯乙酸混匀作对照。然后将所有试管置真空干燥器中接真空泵抽气，反复几次直至叶片沉在管底。将各试管置30℃下于黑暗处保温30min,分别向处理管加1.0ml三氯乙酸，摇匀终止酶活性。

(3)比色：将各试管静置2min,吸取上清液2ml加入另一组试管，以对照管做参比,按标准曲线做法进行显色测定，并计算酶活性(Npg-gi-h-iX

样品中酶活性(ng?g■?■h-1)=~@xt-

式中c:反应液催化产生的亚硝态氮总量（用）；

VI:反应液总体积（ml）;

V2:反应时加入的提取液体积（ml）;

\/\/:样品重量（9）;

t:反应时间（h\