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(一)植物的组织培养的基本过程
一、基础知识
1.植物组织培养的原理
生物体的细胞,具有使后代细胞形成完整个体的能力。
(1)细胞分化:
个体发育中细胞在形态、结构和生理功能上出现稳定性差异的过程。
根本原因:
在特定的时间和空间条件下,基因的选择性表达。
(2)细胞全能性:
离体、营养物质、激素和其他外界条件。
植物细胞表现全能性条件:
2.植物组织培养的基本过程
2.植物组织培养的基本过程
外植体:
离体的植物器官或组织片段。
脱分化(去分化):
高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程。
愈伤组织:
通过细胞分裂形成的,其细胞排列疏松而无规则,高度液泡化呈无定形状态的薄壁细胞。
再分化:
愈伤组织继续进行培养重新分化成根或芽等器官的过程。
【典型例题】
下列有关植物组织培养技术的叙述,正确的是()
A.经脱分化和再分化过程形成的幼芽细胞不具有细胞全能性
B.在愈伤组织培养过程中加入聚乙二醇,可获得染色体加倍的细胞
C.利用纤维素酶和果胶酶去除外植体的细胞壁有利于脱分化的发生
D.培养基中生长素和细胞分裂素的比例将影响愈伤组织分化的方向
D
(二)影响植物组织培养的因素
1.外植体的选取
①不同植物的组织培养难度
例如:烟草和胡萝卜的组织培养较容易,枸杞愈伤组织的芽诱导较难。
②同一植物材料、材料的年龄、保存时间的长短
例如:菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝。
2.培养基的配制(MS培养基)
大量元素:
N、P、K、Ca、Mg、S
微量元素:
B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co
有机物:
甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等
植物激素:
生长素、细胞分裂素、赤霉素等
一般选择植物的幼嫩部分(生命力旺盛,分裂分化能力强;含有的病毒少),比如茎尖、根尖、幼嫩的叶片等;
保存时间越短,材料生命力越旺盛;保存时间越长,越容易受到污染。
微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐;蔗糖提供碳源,同时能够维持细胞的渗透压;甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞对特殊营养的需求。微生物培养基以有机营养为主。MS培养基则需提供大量无机营养。
3.不同植物激素浓度、使用顺序和使用量
使用顺序
实验结果
先生长素,后细胞分裂素
有利于分裂,不利分化
先细胞分裂素后生长素
既分裂也分化
同时使用
分化频率提高
菊花组织培养的条件:pH=5.8、温度、控制在18—22℃、每日光照12h
pH、温度、光照等条件也很重要。
4.环境条件
5.消毒和灭菌
在培养的整个过程中,都需要是一个无菌环境,是成功的关键。
【小结】植物组织培养过程:
离体组织或细胞
细胞分裂素≈生长素
愈伤组织
芽
根
植物体
细胞分裂素生长素
细胞分裂素生长素
【典型例题】
植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性因素。按照不同顺序使用这两类激素,会得到不同的实验结果。若先使用生长素,后使用细胞分裂素,实验结果是()
A.有利于细胞分裂,但细胞不分化
B.细胞既分裂也分化
C.细胞分化频率提高
D.有利于细胞分化,但细胞不分裂
A
制备MS固体培养基
外植体消毒
接种
培养
栽培
移栽
二、实验操作
(一)制备MS培养基
1.配制各种母液
①无机物中大量元素浓缩10倍,微量元素浓缩100倍,常温保存。
②激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液。
③用母液配制培养基时,需要根据各种母液的浓缩倍数,计算用量。
2.配置培养基
添加各种成分→定容→调pH→分装
(成分添加顺序:蒸馏水→琼脂→蔗糖→大量元素→微量元素→有机物→植物激素)
注意:菊花的茎段的组织培养比较容易,不必添加植物激素。
3.灭菌
分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌。
酒精摇动
(二)外植体消毒
流水冲洗
无菌水冲洗
无菌水冲洗
(三)接种
1.接种室消毒
接种前用体积分数为70%的酒精将工作台擦拭一遍,打开紫外灯照射20分钟。工作台消毒后,首先点燃酒精灯。
2.无菌操作
在酒精灯火焰旁完成,每次使用器械后,都需要用火焰灼烧灭菌,接种后立即盖好瓶盖。
3.材料的切取和接种
插入时应注意方向,不要倒插,茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分。彼此之间留出一定空间,从而避免互相污染。
每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶,与接种操作后的锥形瓶一同培养,用以说明培养基制作合格,没有被杂菌污染。
(四)培养
接种后的锥形瓶放在培养箱或培养室中培养。
培养条件:18-22℃,每日光照12小时。
(五)移栽
1.打开封口膜
移栽生根的菊花试管苗之前,应先打开培养瓶的封口膜,让试管苗在培养间生长几日。
2.清洗转移
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